Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
двух солевых мостиков и намного меньше энергии обычных ковалентных
связей, составляющих сотни кДж/моль. Поэтому даже небольших отклонений
внешних условий от тех, которые характерны для микроокружения ферментов в
клетке, может оказаться достаточно, чтобы нарушить структуру и функцию
ферментов, т. е. инактивировать их.
р Для практических целей, однако, часто требуется, чтобы ферменты
работали при повышенных температурах, экстремальных значениях pH, в
присутствии высоких концентраций органических растворителей или
поверхностно-активных веществ и т. п. В связи с этим возникает проблема
существенного увеличения стабильности ферментов.
§ 1. Воздействия и вещества, вызывающие инактивацию ферментов
Все воздействия, приводящие к инактивации ферментов, иногда условно
подразделяют на физические и химические. К физическим относят нагревание
или переохлаждение, облучение (у- и рентгеновское излучение), ультразвук,
сорбцию на
119
границах раздела фаз (типа вода - воздух или жидкость - жидкость).
Химическая инактивация может быть вызвана, например, щелочами и
кислотами, поверхностно-активными веществами, органическими
растворителями, мочевиной и гуанидин-хлоридом, некоторыми окислителями
(например, кислородом или пероксидом водорода) и восстановителями
(например, тиолами, ионами металлов), а также некоторыми ферментами
(например, протеазами или протеинкиназами). Однако попытка
классифицировать инактивационные процессы, основываясь на условном
разделении инактивирующих воздействий на физические и химические,
практически ничего не дает для понимания сути этих процессов. Так,
например, под действием физического фактора (нагревания) в молекуле белка
часто происходят химические изменения: окисление функциональных групп,
гидролиз пептидных связей. С другой стороны, действие таких химических
дена-турантов, как мочевина или гуанидин хлорид, как правило, вызывает
изменения только физического состояния белка (конформационные
перестройки), но не меняет его химическую структуру.
Более информативной, с точки зрения решения стабилизационной задачи,
является классификация инактивационных процессов по молекулярным
механизмам.
§ 2. Молекулярные механизмы инактивации ферментов
Еще в 40-х - начале 50-х годов сложились основные представления о
механизмах инактивации. В наиболее общем случае инактивационный процесс
можно представить в виде двухстадийной схемы:
N 3=tD-*-1, (1)
где N, D и I - соответственно нативная, обратимо денатурированная и
необратимо инактивированная формы белка*. Первая стадия на схеме (1) чаще
всего представляет собой обратимое конформационное изменение; в случае
олигомерных ферментов эта стадия состоит в обратимой диссоциации на
субъединицы. Вслед за обратимыми процессами протекают необратимые стадии
(D-I). Механизмы инактивации ферментов, как правило, классифицируют,
исходя из природы процессов, происходящих именно на второй, необратимой
стадии. Кратко рассмотрим основные инактивационные механизмы.
Агрегация. Очень часто при длительной инкубации в растворе при повышенной
температуре, при экстремальных значениях pH,
* Термин "необратимость" по отношению к инактивации имеет тот смысл что
после снятия инактивациониого воздействия (например, при понижении
температуры после продолжительного нагревания) фермент не во (вращается к
нативной каталитически активной конформации N. Он остается в неактивной
фор ме I и в течение разумных времен наблюдения (часы, сутки) не способен
само произвольно реактивироваться, т. е. перейти в форму N.
120
в присутствии химических денатурантов белки агрегируют. На возможность
такой инактивации оказывает влияние целый ряд факторов: температура, pH и
т. п.; однако решающим среди них является концентрация белка. Поскольку
кинетический порядок уравнения, описывающего стадию агрегации, равен или
даже больше двух, то, естественно, увеличение концентрации белка приводит
к увеличению скорости агрегации и размеров образующихся агрегатов, а
также ускорению инактивации в целом. По этому характерному признаку
(сильная зависимость скорости инактивации от концентрации фермента в
растворе) можно кинетически отличить агрегацию от мономолекулярных
инактивационных механизмов.
Как правило, белковые агрегаты образуются за счет слабых нековалентных
взаимодействий, таких, как гидрофобные взаимодействия, водородные связи.
Однако если в молекулах белков имеются SH-группы или дополнительно к ним
еще S-S-связи, то отдельные молекулы внутри агрегатов могут сшиваться
ковалентными дисульфидными мостиками. Размер и форма нековалентных или
ковалентно-сшитых агрегатов могут изменяться в широких пределах вплоть до
образования отдельной фазы - белковых осадков.
Изменение первичной структуры. Все химические процессы, приводящие к
инактивации белков, можно подразделить на две группы. К первой относятся
реакции разрыва полипептидной цепочки, ко второй - химическая модификация
отдельных функциональных групп белка.
