Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
116
субстратом или продуктом, и, во-вторых, процесс должен быть диффузионно-
контролируемым.
Аллостерические и кооперативные свойства иммобилизованных олигомерных
ферментов. Выше были рассмотрены в основном те ферменты, кинетика
действия которых подчиняется уравнению Михаэлиса - Ментен. Однако в
природе наиболее распространенными являются аллостерические ферменты.
Основная особенность этих ферментов состоит в том, что регуляция их
активности под действием субстратов, продуктов и других метаболитов
клетки осуществляется по кооперативному механизму (подробно об этом
явлении и его кинетическом описании см. в монографии Б. И. Курганова
"Аллостерические ферменты", 1978).
В настоящее время не вызывает сомнения, что решающая роль в механизме
кооперативной регуляции активности принадлежит конформационной
подвижности белков. Поскольку иммобилизация иногда существенно
ограничивает ее, то кооперативные и аллостерические свойства олигомерных
ферментов в иммобилизованном состояния часто отличаются от свойств этих
ферментов в гомогенном растворе. При этом иногда уменьшается или даже
совсем исчезает S-образный характер зависимости скорости реакции от
концентрации субстрата или аллостери-ческого лиганда. Эти зависимости
могут трансформироваться в сигмоидальные, которые характерны для
ферментов, действующих в соответствии с кинетическим уравнением Михаэлиса
¦- Ментен.
Иммобилизованные полиферментные системы. В последние годы получено немало
доказательств того, что многие ферменты в клетках работают в виде
структурно и кинетически единых комплексов. В них проходит цепь
последовательных процессов, когда продукт первого фермента является
субстратом для второго фермента и т. д. В полиферментных комплексах
активность каждой компоненты, как правило, превышает активность
изолированного фермента в гомогенном растворе. Основная причина этого
заключается в том, что в комплексе за счет пространственного сближения и
диффузионных ограничений могут локально концентрироваться промежуточные
соединения: суб-
страты, активаторы, ингибиторы. Эффекта локального концентрирования
удается добиться при иммобилизации нескольких ферментов вместе на одном
носителе.
Первая искусственная биферментная система, основанная на иммобилизованных
ферментах, была создана К. Мосбахом (1970). Гексокиназу и глюкозо-6-
фосфатдегидрогеназу ковалентно присоединяли к носителю; они
последовательно перерабатывали глюкозу в глюкозо-6-лактон-6-фосфат. По
сравнению с системой двух ферментов в растворе эффективность возросла на
40-140%; при этом исчезал индукционный период в активности глюкозо-6-
фосфатдегидрогеназы (второго фермента в последовательности) .
117
К настоящему времени описано несколько десятков иммоби-лизационных
систем, в которых согласованно действуют два, три, четыре и большее число
ферментов. Все они выигрывают в эффективности по сравнению с ферментами в
растворе за счет того, что вблизи активного центра второго (третьего и
т.д.) фермента очень быстро достигается стационарная концентрация его
субстрата.
Иммобилизованные органеллы и клетки. Иногда ферменты используют, не
выделяя их из нативного микроокружения in vivo, а в виде целых клеток или
субклеточных структур - митохондрий, хлоропластов и т. п. Такая форма
биокатализаторов имеет целый ряд преимуществ. Перечислим наиболее важные
из них: сохранность природного микроокружения (которое, как правило,
обеспечивает ферментам повышенную стабильность) и способность
воспроизводить ферменты природным путем при использовании варианта
растущих клеток.
Для придания органеллам или клеткам большей технологичности их
иммобилизуют. Кинетическое описание катализа под действием
иммобилизованных клеток представляет очень сложную проблему. Здесь
необходимо учитывать последовательную цепь диффузионных и кинетических
процессов, осложненных эффектами распределения метаболитов и их активного
транспорта (например, через биологическую мембрану). Для растущих клеток
требуется также учет процессов биосинтеза и биодеградации макромолекул. В
настоящее время еще не созданы математические модели, которые бы
исчерпывающе описывали кинетику действия иммобилизованных клеток, - это
задача ближайшего будущего.
Глава
СТАБИЛЬНОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ
Во Введении отмечалось, что главное преимущество иммобилизованных
ферментов перед свободными (несвязанными) заключается в их большей
технологичности. Одним из проявлений этого является более высокая
стабильность иммобилизованных ферментов по сравнению с нативными. Дело в
том, что ферменты, как класс биологических молекул, обладают очень низкой
стабильностью: стандартная свободная энергия нативной конформации при
обычных условиях (комнатная температура, физиологические значения pH,
нормальное давление, определенный состав среды), как правило, лишь на 20-
60 кДж/моль меньше свободной энергии денатурированной формы. Это
соответствует энергии всего лишь нескольких водородных связей или одного-
