Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
могут приводить к принципиально новым явлениям, не наблюдаемым ранее для
ферментов в гомогенных растворах. Это гистерезисные и колебательные
процессы, обнаруженные Д. Тома с сотрудниками в начале 70-х годов.
Причины возникновения этих необычных явлений удобно проследить на одном
частном примере - ингибировании фермента субстратом.
Зависимость ферментативной активности от концентрации
114
субстрата определяется дву- Активность % мя взаимосвязанными факторами:
степенью диффузионных ограничений субстрата и его концентрацией в
свободном растворе. При этом-чем выше концентрация субстрата и чем ниже
исходная активность фермента, тем больше вероятность, что ферментативная
реакция будет протекать в кинетическом режиме. Поэтому понятно, что
увеличение концентрации субстрата, сопровождаемое снижением
ферментативной активности (за счет ингибирования фермента), может вызвать
резкий переход реакции из диффузионного режима в кинетический.
Рассмотрим этот вывод подробнее. Согласно первому закону Фика скорость
переноса субстрата к ферменту прямо пропорциональна концентрации
субстрата у поверхности носителя. Катализируемая иммобилизованным
ферментом реакция достигает стационарного состояния, когда скорость
переноса субстрата к ферменту становится равной скорости его
ферментативной трансформации. На рис. 22 стационарные состояния задаются
точками пересечения кривой зависимости ферментативной активности от
концентрации субстрата с прямой скорости диффузии субстрата к ферменту.
При высоких скоростях диффузии, т. е. незначительных диффузионных
ограничениях (прямая 1), так и при низких скоростях диффузии, т. е.
весьма больших диффузионных ограничениях (прямая 3), на рис. 22
наблюдается лишь одна точка пересечения - одно стационарное состояние.
При промежуточных скоростях диффузии (прямая 2) имеется три точки
пересечения, т. е. допустимы три различных стационарных состояния. Если
построить график зависимости реальной скорости ферментативной реакции от
концентрации субстрата, то при высоких и низких значениях концентрации
субстрата возможно только одно стационарное состояние, а при
промежуточных значениях - три состояния: А, В и С. Таким образом,
получаем гистерезисную
Рис. 22. Влияние ограничения диффузии субстрата на кинетику действия
иммобилизованного фермента, подверженного ингибированию субстратом:
прямые 1,2 и 3 - зависимости скорости диффузии субстрата к ферменту от
[S]o; кривая 4 - .зависимость скорости ферментативной реакции от
концентрации субстрата в отсутствие диффузионных ограничений; точки (А,
В, С, D, Е) - стационарные состояния, когда скорость диффузии субстрата к
ферменту равна скорости реакции для иммобилизованного фермента
115
кривую (рис. 23). Она означает, что скорость ферментативной реакции
определяется не только концентрацией субстрата во внешнем растворе, но и
зависит от направления изменения концентрации субстрата. Так, при
повышении концентрации субстрата во внешнем растворе скорость
ферментативной реакции увеличивается. Однако при достижении некоторой
критической концентрации субстрата система переходит из диффузионной
области в кинетическую и скорость реакции существенно падает (рис. 23).
При понижении концентрации субстрата скорость реакции остается низкой до
тех пор пока не произойдет обратный переход из кинетической области в
диффузионную. При дальнейшем уменьшении концентрации субстрата скорость
ферментативной реакции снова начнет падать.
Причины того же характера приводят к появлению внутри-мембранных
колебательных процессов. В качестве одного из примеров приведем
катализируемый папаином, иммобилизованным в искусственной мембране,
гидролиз этилового эфира И-бензоил-Ь-аргинина. Один из продуктов
ферментативной реакции - аминокислота, накапливается в мембране (за счет
ограничения диффузии) и тем самым сдвигает pH внутри мембраны в сторону
более кислых значений. Это неизбежно уменьшает гидролитическую активность
папаина, так как фермент "выходит" из своего pH-оптимума активности. В
дальнейшем за счет более быстрой диффузии Н+ по сравнению с ОН~возрастает
значение pH внутри мембраны и активность папаина снова увеличивается.
Таким образом, был получен микрореактор с периодом колебания 20 с.
Изменением концентрации фермента в мембране, толщины мембраны и других
параметров системы удается варьировать продолжительность одного
колебания.
Анализ условий, при которых могут наблюдаться гистерезис-иые и
колебательные явления, показал, что для их возникновения необходимо,
чтобы, во-первых, на зависимости скорости ферментативной реакции от
концентрации субстрата имелся максимум или точка перегиба, т. е. фермент
активируется или ингибируется
Рис. 23. Гистерезисная зависимость реальной скорости реакции для
иммобилизованного фермента, подверженного ингибированию субстратом, при
диффузионных ограничениях субстрата от его концентрации; стрел ки
обозначено направление изменения концентрации субстрата [S] о в системе
