Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
наблюдаться изменений pH-зависимости активности. Но даже в такой системе
вид кривой зависимости активности фермента от pH может измениться, если
лимитирующей стадией реакции является диффузия субстрата.
Эффекты ингибирования и активации в катализе иммобилизованными
ферментами. Полимерный носитель может вносить свою специфику и в действие
таких регуляторов ферментативной активности, как ингибиторы и активаторы.
Низкомолекулярные ингибиторы и активаторы. Влияние низкомолекулярного
ингибитора на фермент определяется, в основном, распределением молекул
ингибитора между фазой носителя и раствором. Диффузионные ограничения,
как правило, не изменяют характер ингибирования фермента после достижения
стационарного состояния.
Наиболее прост для анализа тот случай, когда носитель не накладывает
ограничения на диффузию субстрата и характер ингибирования целиком
определяется распределением субстрата и ингибитора между матрицей и
раствором. Если ингибитор и полимерный носитель одноименно заряжены, то
степень ингибирования снижается (по сравнению с ситуацией в гомогенном
растворе), а если они несут на себе заряды противоположного знака, то
степень ингибирования возрастает. Если в последнем случае субстрат имеет
одинаковый заряд с носителем, то степень ингибирования еще более
увеличивается. В данном изложении не будут рассмотрены конкретные
примеры: случаи конкурентного и неконкурентного ингибирования,
ингибирования продуктом реакции и т. п. Читатель может это проделать сам
в качестве упражнения и вывести соответствующие математические выражения.
Анализ этих систем показывает, что во всех случаях кинетика действия
иммобилизованных ферментов, осложненная ингибированием, описывается
уравнением Михаэлиса - Ментен.
Несколько более сложную задачу представляет описание ингибирования при
наличии диффузионных ограничений для субстрата. Можно показать, что при
очень сильном ограничении диффузии субстрата иммобилизованный фермент
может вообще не реагировать на добавление ингибитора, и скорость реакции
определяется скоростью диффузии субстрата. При достаточно высоких
концентрацих субстрата процесс может перейти в кинетическую область и
присутствие ингибитора становится заметным. Если же диффузия субстрата
ограничена незначительно, то ингибитор будет подавлять активность
иммобилизованного фермента. В промежуточных случаях степень ингибирования
фермента постепенно снижается по мере того, как повышается уровень
ограничений в диффузии субстрата.
Высокомолекулярные ингибиторы. Активность некоторых ферментов in vivo, в
первую очередь протеаз, регулируется ингибиторами белковой природы с
молекулярными массами
113
около 10 ООО и выше. Естественно, их действие на иммобилизованные
ферменты может осложняться как диффузионными ограничениями, так и
стерическими затруднениями. Оба этих эффекта будут препятствовать
контакту молекулы ингибитора с ферментом и тем самым уменьшать
эффективность ингибирования.
Ингибирование продуктом реакции. Все рассмотренные соображения
справедливы и для этого частного случая ингибирования. Однако при
ограничении диффузии продукта не может быть справедливым допущение о
равномерном распределении ингибитора в фазах свободного раствора и
носителя. Проанализируем, к каким кинетическим последствиям может
привести этот фактор.
Во-первых, концентрация продукта-ингибитора в микроокружении фермента
должна быть существенно выше, чем в свободном растворе. Следовательно,
иммобилизованный фермент может заметно ингибироваться даже тогда, когда
концентрация продукта во внешнем растворе мала. Во-вторых, в случае
внутридиффузионных ограничений продукта концентрация субстрата будет
убывать по направлению к центру частицы, а концентрация продукта будет
увеличиваться в том же направлении. Иными словами, степень ингибирования
иммобилизованного фермента, находящегося в глубине частицы носителя,
будет существенно выше, чем на границе раздела с внешним раствором.
В зависимости от того, по какому механизму происходит ингибирование
продуктом, изменяется потенциально достижимое значение максимальной
скорости ферментативной реакции V. Если продукт - конкурентный ингибитор,
то при высоких концентрациях субстрата удается преодолеть и ограничение
диффузии, и ингибирование продуктом (т. е. достичь значения V в
отсутствие ингибирования). В случае неконкурентного ингибирования
продуктом оптимальное значение скорости реакции (в условиях насыщения
фермента субстратом) никогда не достигнет значения V. Чем эффективнее
носитель препятствует свободной диффузии, тем более существенные различия
в этих значениях будут наблюдаться.
Резюмируя, можно сказать, что диффузионные ограничения играют роль
своеобразного кинетического буфера по отношению к экзогенному эффектору
(ингибитору или активатору).
Гистерезисные и колебательные явления в катализе иммобилизованными
ферментами. Диффузные ограничения в катализе иммобилизованными ферментами
