Иммобилизованные ферменты - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
молекулярной массой. Стерические ограничения иногда удается уменьшить или
даже полностью устранить путем деградации носителей под действием
химических реагентов (мягкой обработкой окислителями, кислотами и т. п.)
или специальными ферментами (декстраназой, цел-люлазой и др.). При этом
важно, чтобы такая обработка не затронула первичную структуру и не
нарушила пространственную организацию ферментов, пришитых к носителю.
pH-Эффекты в катализе иммобилизованными ферментами. Из ферментативной
кинетики хорошо известно, что скорости реакций с участием ферментов в
гомогенном растворе сильно зависят от значения pH. Это обусловлено тем,
что в катализе участвуют функциональные группы белка, способные
протонироваться или депро-тонироваться в зависимости от pH в растворе, а
реакционноспособной является, как правило, только одна из форм.
В принципе pH-эффекты в катализе иммобилизованными ферментами описываются
теми же закономерностями, которые были рассмотрены при анализе
распределения субстрата. Однако ионы Н+ и ОН~ относятся к числу наиболее
общих эффекторов ферментативной активности, поэтому вопрос о влиянии их
распределения и диффузии на кинетику действия гетерогенных
биокатализаторов необходимо рассмотреть отдельно.
1. Распределение протонов. В качестве примера рассмотрим
108
Рис. 18. Гипотетические рН-завйсимости каталитической активности
свободного (неиммобилизован-ного) фермента (кривая 2), иммобилизованного
на поликатионном (кривая 1), полианионном (кривая 3) носителях
фермент, иммобилизованный на полиэлектролитиом носителе. Пусть для
определенности оптимум действия фермента в гомогенном растворе
наблюдается при pH 8, а кривая зависимости активности от pH имеет
колоколообразный вид (кривая 2 на рис. 18). Если для работы с
иммобилизованным ферментом значение pH во внешнем растворе выбрать равным
8, то из-за эффекта распределения протонов внутри полиэлектролитной
матрицы оно будет другим. Так, если фермент иммобилизован на полианионном
носителе, то внутри него концентрация протонов выше, чем во внешнем
растворе (сдвиг в сторону более кислых значений pH); обратная картина
имеет место в случае поликатионного носителя. Это приведет к тому, что
фермент, иммобилизованный как на поликатионном (кривая 1 на рис. 18), так
и на полианионном (кривая 3 на рис. 18) носителе, будет работать не с
полной эффективностью, хотя значение pH во внешнем растворе
соответствуюет оптимуму его каталитической активности.
Подобные изменения pH-зависимости ферментативной активности часто
наблюдаются в реальных системах. Они целиком обусловлены присутствием на
полиэлектролитиом носителе заряженных групп. Добавление в систему
с.иммобилизованным ферментом высококонцентрированных растворов солей или
буферных систем вызывает экранирование зарядов групп носителя и,
следовательно, уменьшение сдвигов рН-оптимумов активности. Иными словами,
сдвиг pH-зависимостей активности иммобилизованных ферментов,
обусловленный распределением протонов, наблюдается только в разбавленных
буферных растворах с низкой ионной силой. С другой стороны, зависимость
сдвига pH-оптимума активности от ионной силы служит серьезным указанием
на то, что распределение протонов между раствором и носителем играет
109
важную роль в катализе иммобилизованным препаратом фермента.
2. Ограничение диффузии протонов. Полимерный носитель, на котором
иммобилизован фермент, может препятствовать свободной диффузии протонов
внутри частицы носителя. Это связано с тем, что внутри частицы носителя
существенно заторможена диффузия протонов по механизму, характерному для
гомогенного раствора. Поскольку концентрация протонов в системе обычно
мала (10-7 моль/л или ниже), то даже небольшой избыток (или, наоборот,
дефицит), обусловленный торможением диффузии, может вызвать заметное
изменение pH внутри частицы. Это, в свою очередь, приведет к
существенному изменению рН-зависимости каталитической активности,
особенно для тех ферментативных реакций, в которых протоны являются
субстратом или продуктом (как, например, при действии гидролаз,
дегидрогеназ, киназ и некоторых других ферментов).
Пусть, например, фермент, иммобилизованный на носителе, катализирует
реакцию, сопровождающуюся образованием протонов, в отсутствие буферного
раствора. После начала реакции в матрице начинают накапливаться протоны,
что приводит к появлению градиента концентрации протонов и последующей их
диффузии из частицы во внешний раствор. Однако если диффузия заторможена,
то протоны накапливаются внутри частицы и вызывают уменьшение pH в
микроокружении фермента. Это, в свою очередь, влияет на скорость
ферментативной реакции, а значит, и на скорость выделения протонов -
продукта ферментативной реакции. Если pH внутри частицы до начала реакции
выше pH-оптимума фермента, то образующиеся в ходе реакции протоны снижают
pH, повышая тем самым скорость ферментативной реакции, т. е. скорость
выделения протонов. В результате значение pH частицы уменьшается еще
