Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
прохождении через область креста образуют пики. Далее следуют этапы
анализа "силовых линий" (В) и преобразования их в дискретные зоны (Г).
После интегрального анализа интенсивности дискретных зон получают
денситограммы (на рис. не показаны), по форме записи аналогичные тем,
которые получаются при сканировании обычных (одномерных) гелей.
3.3.4. Радиоавтография и флюорография
Введение радиоактивной метки в белки можно осуществить или
биосинтетически с использованием меченых аминокислот, или искусственным
путем - с помощью реакций иодирования
Аналитическое ИЭФ
231
(Samols, Williams, 1961) или восстановительного метилирования
(Kumarasamy, Symons, 1979), а при работе с антителами - С использованием
радиоактивных гаптенов (Williamson, 1971), меченных радиоактивным иодом
антигенов (Keck et al., 1973а,b) и т. п. Для мечения белков можно
использовать любые доступные радиоактивные реагенты, которые могут
химически модифицировать аминогруппы, SH-группы, имидазольное кольцо,
фенольные или алифатические гидроксилы (список подобных реагентов
приведен в Приложении II книги Hames, Rickwood, 1981). Многие из
реагентов этого типа изменяют суммарный заряд белка, и, чтобы избежать
образования артефактных множественных форм, лучше проводить модификацию
белков не до, а покле ИЭФ.
Для регистрации радиоактивных зон используют один из двух основных
экспериментальных подходов. В первом варианте на гель накладывают
рентгеновскую пленку, в которой под воздействием радиоактивного излучения
из галогенида серебра образуется металлическое серебро. "Засвеченные"
участки, соответствующие радиоактивным зонам, можно наблюдать визуально
после проявления пленки. Другой подход заключается в разрезании геля на
сегменты и определении содержания меченого белка в них с помощью
сцинтилляционного счетчика. Этот метод часто применяют для
количественного определения белков, особенно при использовании двойной
метки. Однако разрешающая способность в этом случае лимитируется шириной
сегментов геля, которую, как правило, не удается сделать менее 0,5 мм.
Метод регистрации на рентгеновской пленке применяют в четырех основных
вариантах: прямая радиоавтография, флюорография, непрямая радиоавтография
и регистрация двойной метки. Рассмотрим вкратце каждый из этих вариантов.
Прямая радиоавтография. Белки, меченные 32Р или 1251, можно
регистрировать непосредственно во влажных плоских или цилиндрических
гелях, помещая их в герметически закрывающийся пакет, на который
накладывают рентгеновскую пленку. Разрешение удается заметно повысить,
если гель предварительно высушить на листе фильтровальной бумаги (ватман
ЗММ; см. разд. 3.2.15). Обычно перед высушиванием гель окрашивают кумасси
синим и отмывают от фона. Таким образом, радиоавтограмму удается
сопоставить с обычной картиной белкового окрашивания. Для облегчения
такого сопоставления удобно пометить бумагу, на которой находится
высушенный гель, радиоактивными чернилами (14С~1 мкКи/мл) в нескольких
точках по периметру геля. Рентгеновскую пленку накладывают прямо на
окрашенный гель, зажимают в специальной ра-диоавтографическоп кассете или
просто между двумя стеклян-
232
Глава 3
ными пластинками с помощью металлических зажимов и помещают в черный
пластиковый пакет или в светонепроницаемую коробку. После экспонирования
пленку проявляют в соответствии с предписаниями фирмы-изготовителя.
При прямой радиоавтографии (время экспозиции 24 ч) высушенного ПААГ с
помощью пленки Kodirex различимые пятна, имеющие As4o^O,02, удается
получить при содержании метки, соответствующем 6000 расп./(мин-см2) для
14С или 35S, 1600 расп./(мин-см2) для 1251 и 500 расп./(мин-см2) для 32Р
(Laskey, Mills, 1975, 1977). Величина поглощения в пятне пропорциональна
радиоактивности соответствующей зоны. Таким способом не удается
зарегистрировать 3Н-метку, поскольку мягкое P-излучение трития не
проходит через слой геля. Обнаружить тритиевую метку можно с помощью
флюорографии, обладающей, кроме того, большей чувствительностью к
излучению 14С и 35S, чем прямая радиоавтография. Разработан также метод
так называемой "непрямой" радиоавтографии, позволяющей повысить
эффективность регистрации 1251 и 32Р (Laskey, Mills, 1977). Методические
основы флюорографии и непрямой радио-автографии недавно были рассмотрены
в обзоре Laskey, 1980.
Флюорография (для 3Н, 14С и 35S). Для флюорографической регистрации метки
в гель импрегнируют сцинтиллятор (2,5-ди-фенилоксазол, или ППО),
высушивают, накладывают на него рентгеновскую пленку и, экспонируют при -
70 °С. При более высоких температурах чувствительность метода заметно
понижается. Метод основан на том, что, хотя низкоэнергетические (5-
частицы, образующиеся при распаде трития, не могут проникнуть через
матрицу геля и дойти до пленки, они взаимодействуют с молекулами ППО в
геле. При этом энергия радиоактивного распада преобразуется в энергию
видимого света, который в свою очередь регистрируется -рентгеновской
