Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 98

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 92 93 94 95 96 97 < 98 > 99 100 101 102 103 104 .. 171 >> Следующая

необходимость в проведении длительной процедуры вымачивания геля в ДМСО,
а затем в воде. При использовании салицилата натрия процесс подготовки
геля и флюорографии занимает 0,5 ч вместо обычных пяти. При работе с
предварительно засвеченными рентгеновскими пленками чувствительность
флюорографии с использованием салицилата, судя по всему, не ниже, чем в
случае обычной ДМСО-ППО-системы. Наблю-
Таблица 3.7. Предварительное слабое засвечивание рентгеновской пленки для
проведения количественной флюорографии (Hames, 1981)
Предварительное засвечивание проводят с помощью однократного импульса от
электронной "вспышки" типа Vivitar 283. Длительность импульса не должна
превышать 1 мс, поскольку более продолжительное экспонирование приводит
только к усилению фона (вуали) без дальнейшего повышения чувствительности
пленки. Во избежание недоэкспонирования, которое может быть вызвано
неполной зарядкой конденсатора, "вспышку" следует включать не ранее чем
через 30 с после пробного запуска. Для снижения интенсивности и для
рассеяния света на окошке "вспышки" закрепляются соответствующие фильтры.
1. Непосредственно перед окошком помещают инфракрасный фильтр для защиты
других фильтров от выделяющегося тепла.
2. Для уменьшения интенсивности света ставят цветной фильтр. Используют
оранжевые фильтры фирмы Kodak: Deep Orange, Kodak Wratten № 22 - для
сильных "вспышек" типа упомянутой выше или Orange № 21-для более слабых.
3. Для дополнительного рассеяния света от "вспышки" и, следовательно, для
равномерного засвечивания пленки используют лист фильтровальной бумаги
(например, ватман № 1). Интенсивность освещения можно немного
варьировать, изменяя расстояние между лампой и пленкой (обычно 60- 70
см), а также апертуру окошка "вспышки". При засвечивании под пленку
подкладывают желтую бумагу. После обработки пленку накладывают
засвеченной стороной на гель. Степень засвеченности пленки контролируют с
помощью обычного спектрофотометра, сравнивая величину ее фонового
поглощения при 540 нм с поглощением необработанной пленки. Предварительно
засвеченная пленка не подлежит длительному хранению.
Аналитическое ИЭФ
235
дается аналогичная линейная зависимость между поглощением пятен на
флюорограмме и радиоактивностью в соответствующих зонах. Был предложен и
еще один вариант обработки геля - вымачивание в растворе ППО,
приготовленном в ледяной уксусной кислоте (Pulleyblank, Booth, 1981).
Этот метод можно использовать при работе как с полиакриламидными, так и с
агарозными матрицами (ДМСО растворяет агарозный гель!). Кроме того, в
отличие от вымачивания в ДМСО, обработка уксусной кислотой не приводит к
обесцвечиванию белковых зон, окрашенных кумасси синим. Окраска белка не
влияет на чувствительность флюорографии, поскольку спектр поглощения
окрашенных белков (красная область) не перекрывается со спектром
испускания ППО (синяя область).
Непрямая радиоавтография (для 32Р или 1251). Метод заключается в том, что
после наложения предварительно засвеченной рентгеновской пленки на гель
(влажный или высушенный, окрашенный или нет) эту пленку сверху закрывают
интенсифицирующим экраном из вольфрамата кальция и экспонируют при - 70
°С (Laskey, Mills, 1977). Излучение частично поглощается пленкой и дает
обычную радиоавтографическую картину, а частично проходит через пленку и
более эффективно поглощается экраном. Это порождает интенсивное ответное
свечение материала экрана, которое в свою очередь поглощается пленкой и
значительно интенсифицирует радиоавтографическую картину.
Разрешающая способность такого метода по сравнению с прямой
радиоавтографией снижается лишь ненамного, а чувствительность повышается
весьма существенно. Так, при использовании пленки X-Omat R (Kodak),
засвеченной до /4s4o = 0,15, и интенсифицирующего экрана типа Fuji Mach
II или Dupont Cronex Lightning Plus эффективность регистрации для 32Р
повышается в 10,5 раза, а для 1251 - в 16 раз по сравнению с обычной
радиоавтографией. Это означает, что при содержании метки, отвечающей 50
расп. (32Р)/(мин-см2) или 100 расп. (1251)/(мин*см2), наблюдается
заметное почернение пленки после проявления. При непрямой радиоавтографии
сохраняется линейное соотношение между радиоактивностью и поглощением
пятна на радиоавтограмме, что позволяет проводить количественное
определение метки. Большое значение имгеет правильный выбор экрана (его
можно использовать многократно). Наилучшие результаты удается получить с
помощью упомянутых выше экранов Fuji Mach II и Dupont Lightning Plus.
Данные об эффективности использования экранов других марок содержатся в
работе Laskey, Mills, 1977.
Регистрация двойной метки с помощью рентгеновской пленки. Интересный
метод, особенно эффективный при сравнении двумерных белковых карт двух
разных тканей или клеточных ли-
236
Глава 3
ний, был предложен в работе Choo et al., 1980. Две клеточные линии
выращивают в присутствии двух разных изотопов, например 14С и 3Н,
Предыдущая << 1 .. 92 93 94 95 96 97 < 98 > 99 100 101 102 103 104 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed