Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
обычного диск-электрофореза в геле. После ИЭФ в аппарате, описанном в
работе Righetti, Drysdale, 1971* гели можно сканировать в
Аналитическое ИЭФ
22?
10-см кювете регистрирующего спектрофотометра фирмы Gilford ¦(модель
240), который снабжен системой линейного перемещения кюветы. Стандартные
кварцевые или стеклянные трубки с гелем можно закрепить прямо в
кюветодержателе и проводить сканирование, не извлекая гелей из трубок. В
работе Fawcett, 1970, для сканирования гелей при постоянной длине волны,
а также для получения спектров отдельных компонентов использовался
спектрофотометр Amicon SP 800. Была предложена' система сканирования,
позволяющая контролировать процесс разделения непосредственно в ходе ИЭФ
в градиенте плотности (Castimpoolas, 1973с). При этом ИЭФ проводилось
прямо в вертикальной кварцевой кювете, закрепленной в кюветодержателе
модифицированного сканирующего устройства спектрофотометра фирмы Gilford.
Благодаря непрерывному сканированию можно проследить за миграцией белков
на всех этапах фракционирования. Эта система позволяет получить наиболее
достоверную картину разделения при аналитическом ИЭФ в сахарозном
градиенте плотности, поскольку дает возможность зарегистрировать близкие
пики, которые в процессе элюции могли бы перекрыться. Сканирование в ходе
ИЭФ помогает также точно определить момент достижения равновесия, что
весьма существенно для предотвращения дестабилизации градиента pH при
слишком продолжительном электролизе (за счет катодного дрейфа; Righetti,
Drysdale, 1971, 1973).
Для денситометрирования после ИЭФ в плоском слое геля в работе Radola,
1973b, использовался спектрофотометр SD3000 фирмы Schoeffel Instruments
(Westwood, NJ, USA). Для сканирования цилиндрических и плоских гелей,
слоев гранулированного геля, ацетилцеллюлозных мембран и бумажных реплик
(размером до 20x20 см) в режиме регистрации проходящего или отраженного
света, а также флуоресценции может использоваться спектрофотометр фирмы
Zeiss (модель MPQ II, предназначенная для хроматографического анализа).
Этот сканирующий спектрофотометр может применяться и для получения
спектров индивидуальных сфокусированных зон. Описано устройство,
позволяющее с помощью спектрофотометра Beckman DH проводить сканирование
после ИЭФ в 2-мм слре сефадекса G-200 (Holmquist, Brostrdm, 1979). Это
позволяет' регистрировать сфокусированные зоны без применения бумажных
реплик.
Лимитирующим фактором при денситометрировании окрашенных белковых зон
является разрешающая способность сканирующего устройства. Абсолютную
разрешающую способность при сканировании можно определить как минимальное
расстояние между двумя дискретными пиками, которое еще может быть
зарегистрировано в виде четкого минимума, доходящего до базовой линии. По
этому критерию самые совершенные сканф
15*
228
Глава 3
рующие устройства характеризуются предельным разрешением 230 мкм. Иначе
говоря, для того чтобы перо самописца достигало базовой линии в интервале
между пиками, протяженность этого интервала должна быть не меньше 230
мкм. Фактически же в большинстве сканирующих устройств предел разрешения
пиков значительно выше - около 1 мм и более.
Разрешающую способность можно было бы повысить за счет сужения щели
спектрофотометра. Однако, как утверждается в работе Zeineh et al., 1975,
при ширине щели менее 100 мкм разрешение не только не повышается, но
становится более низким из-за расхождения пучка света после прохождения
через такую узкую щель. Другая проблема, возникающая при использовании
очень узкой щели, особенно в УФ-области, связана с тем, что при этом
становится слишком малой энергия пучка света и соответственно снижается
чувствительность детектирования. Таким образом, доступные в настоящее
время сканирующие устройства по разрешающей способности не соответствуют
потребностям ИЭФ, для которого - особенно в случае использования тонких
гелей - уровень разрешения при сканировании часто должен достигать 50
мкм.
Для решения этой проблемы в работе Zeineh et al., 1975, был использован
лазерный сканирующий денситометр с мягким излучением. В этом приборе
сканирование проводится с помощью монохроматического когерентного пучка
света, поляризованного в плоскости щели, с длиной волны 633 нм. Такое
ден-ситометрирование в красном свете эффективно при регистрации белковых
зон, окрашенных кумасси, или зон иммунопреципитации, а также для
нефелометрии. В то же время белковые зоны, окрашенные с помощью Ponceau S
или других красных красителей, при работе на этой длине волны окажутся
прозрачными. Выпускается также УФ-лазер с мягким излучением для
регистрации белковых зон по флуоресценции или поглощению при 320 нм. Эта
модель лазерного сканирующего устройства отличается от других тем, что
ширина пучка в ней не регулируется вручную с помощью щели, а
контролируется автоматической внутренней подстройкой. Это позволяет
регистрировать микроскопические зоны (пятна) шириной всего лишь 3-10 мкм.
