Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 100

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 94 95 96 97 98 99 < 100 > 101 102 103 104 105 106 .. 171 >> Следующая

оказывается сконцентрированной близко к поверхности трубки при довольно
низком его содержании в центре
238
Глава 3
зоны. Это.создает благоприятные условия для протекания перекрестной
реакции с антителами.
В другом варианте гель разрезают на сегменты, которые измельчают и
переносят в лунки, проделанные в пластине агарового геля. В центральную
лунку заливают антисыворотку и проводят иммунодиффузию в течение 48 ч
(секционное иммуно-электрофокусирование по Catsimpoolas, 1969b). В
пластину агарового геля можно поместить и неразрезанный столбик
полиакриламидного геля. Для этого в пластине параллельно столбику
вырезают щели, в которые заливают соответствующую антисыворотку (Spragg
et al., 1973). После ИЭФ в тонком плоском геле пластину ПААГ можно
покрыть полосками фильтровальной бумаги, смоченными раствором
соответствующих антител (Cotton, Milstein, 1973). Кроме того, полоску
ПААГ можно поместить в пластину агарового геля между двумя параллельными
щелями, заполненными антисывороткой (Dewar, Latner, 1970). Более
совершенный метод непрямой иммунофиксации заключается в том, что на
пластину геля после ИЭФ накладывают полоску ацетилцеллюлозной пленки,
импрегнирован-ную раствором специфических антител. Этот метод
использовался для регистрации фенотипических вариантов ai-антитрип-сина
(Arnaud et al., 1977) и различных сывороточных белков (Johnson, 1978). В
работе Stibler, 1979, предложена методика прямой иммунофиксации для
регистрации белков спинномозговой жидкости и сыворотки. После ИЭФ
соответствующий объем антисыворотки распределяли прямо по поверхности
геля над треком, в котором происходила миграция данного белка. Эта
методика проста в исполнении, однако требует значительного расхода
антисыворотки.
Были предложены и другие иммунологические методы детектирования. Так,
сфокусированные антигены можно обнаружить, обрабатывая гель раствором
антител, а затем инкубируя его в растворе, содержащем антииммуноглобулин
G, "сшитый" с пероксидазой из хрена (Olden, Yamada, 1977). При
последующей инкубации с перекисью водорода и 3,3'-диаминобензидином
комплексы антиген-антитело-пероксидаза проявляются в виде окрашенных зон.
Антигены можно также обнаружить с помощью радиоавтографии после обработки
геля радиоактивными антителами. В "методе двух антител" лучше
использовать меченые вторичные антитела. Вместо вторичных антител можно
использовать меченный 1251 белок А из Staphylococcus aureus (он
связывается с константными Fc-участками молекул IgG) (Burridge, 1978).
Для получения удовлетворительного отношения радиоактивности в зонах к
фоновой радиоактивности гель следует тщательно отмывать от избытка метки.
Многообещающей модификацией метода является вариант е получением
Аналитическое ИЭФ
23"
реплики с геля на диазобензилоксиметил (ДБМ-)-бумагу. Белки частично
переходят на ДБМ-бумагу и связываются с ней ковалентно (Renart et al.,
1979). Для регистрации определенных антигенов реплику последовательно
обрабатывают первичными специфическими антителами, а затем меченным 1251
белком А из S. aureus. Последующая радиоавтография выявляет
соответствующие белковые зоны. Антитела и белок А удаляют с бумаги
обработкой мочевиной и меркаптоэтанолом. После этого реплику можно
использовать для дальнейшего тестирования с помощью антител с иной
специфичностью.
3.3.6. Специфические методы окраски и метод зимограмм
Большинство специфических красителей, используемых для регистрации белков
определенного типа после электрофореза в геле, можно с таким же успехом
применять и после ИЭФ в геле. Специфичность некоторых из этих красителей
определяется присутствием в белке какого-либо кофактора - металла или
про-стетической группы, например гема, а также других компонентов -
углеводов, липидов и т. д. Применение других специфических методов
регистрации белков основано на их биологической активности. Ниже
приведены отдельные примеры, иллюстрирующие возможности применения
различных специфических методов окрашивания.
Гистохимическое окрашивание. Для обнаружения связанных с белком
компонентов небелковой природы нередко удается использовать специфические
красители. В случае металлосодержащих белков, таких, как трансферрин
(Latner, 1973), церулоплазмин (Latner, 1973) или ферритин (Drysdale,
1970), белковые зоны можно локализовать по специфической цветной реакции
на ион металла. Кроме того, белки, содержащие ионы металлов, можно
обнаружить с помощью метода нейтронной активации. Для этого образец в
запаянной ампуле из высокоочищен-ного кварцевого стекла помещают в
реактор и облучают тепловыми нейтронами. Интенсивность у-излучения
образующихся Долгоживущих радионуклидов определяют с помощью детектора
Geli (фирмы Ortec), соединенного с многоканальным анализатором
(Intertechnique). Этот метод был использован для ¦определения связанных с
сывороточными белками микроэлементов, таких, как селен, хром, цинк,
кадмий, железо, кобальт и сурьма (Schmelzer, Behne, 1975). С помощью
Предыдущая << 1 .. 94 95 96 97 98 99 < 100 > 101 102 103 104 105 106 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed