Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 91

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 85 86 87 88 89 90 < 91 > 92 93 94 95 96 97 .. 171 >> Следующая

через 15-30 мин). После этого в течение нескольких минут вымывали ТХУ
смесью метанол - вода - уксусная кислота (33 : 66: 10). Окрашивали
реплику 15-30 мин, время от времени перемешивая раствор, а затем отмывали
фон в нескольких сменах (по 5-15 мин) соответствующего раствора. Жидкость
от первых двух промывок отбрасывали, а от других промывок - обесцвечивали
активированным углем и использовали снова.
*) В удалении амфолитов-носителей нет необходимости, но однократное
промывание ТХУ способствует быстрому и более равномерному удалению фона
при последующих промывках.
*) Для красителя Light Green SF время, необходимое для полного отмывания
фона, составляло 20-30 мин.
8) Число мкг белка при нанесении образца в виде 18-мм зоны.
Аналитическое ИЭФ
221
флуорескамин (Stein et al., 1973; Handschin, Ritschard, 1976)' и 2-
метокси-2,4-дифенил-3(2Н)-фуранон (МДФФ) (Barger et al.,.
1976). С помощью последнего реагента удается регистрировать, вплоть до 1
нг белка в зоне. Однако, за исключением случаев; введения следовых
количеств метки в образец, как правило,, нельзя быть уверенным, что в
результате предварительного окра* шивания не изменятся истинные значения
pi белков и не произойдет искусственного повышения гетерогенности
исследуемой смеси. Поэтому такие методы, как и предварительное
ковалентное связывание катионного красителя типа Drimarene Brilliant Blue
K-BL (Bosshard, Datyner, 1977), практически неприменимы для анализа
методом ИЭФ. Сообщалось, что на самом деле предварительное окрашивание
некоторых белков флуоресками-ном оказывает влияние даже на их подвижность
при электрофорезе в ДДС-Na, где, вообще говоря, подвижность должна
зависеть только от массы молекул (Ragland et al., 1974). Если' учесть,
что реакция флуорескамина с белками, по существу, приводит к замене
аминогрупп в белках на карбоксильные, то становится понятным, что
подробная обработка обязательно приведет к изменению эффективных значений
pi даже при введении1 следовых количеств метки.
В табл. 3.3 указаны различные методы окрашивания бумажных реплик,
полученных после ИЭФ в слое гранулированного* геля (Radola, 1973а). В
табл. 3.4 перечислены наиболее популярные красители, используемые при
электрофорезе и ИЭФ:
S.3.2. Окрашивание серебром
Этот метод представляет собой, пожалуй, самое поразительное достижение в
развитии методов окрашивания белков. Считается, что по чувствительности
он, как минимум, в 100 раз-превосходит окрашивание СВВ, т. е.
приближается к радиоавтографии. Впервые метод был описан в работе Switzer
et al., 1979, в качестве модифицированного варианта медно-серебряного
окрашивания (по de Olmo, 1969). Я приведу здесь три важнейших методики:
упрощенный вариант (Oakley et al,, 1980),. фотохимическое окрашивание
(Merril et al., 1981). и цветное-¦окрашивание (Sammons et al., 1981).
1. Упрощенная методика окрашиванния серебром по Oakley-et al., 1980
(была разработана для пластин геля размером 140x140x0,8 мм). 1-й этап.
Гель вымачивают 30 мин в 10%-ном водном растворе глутарового альдегида.
[В случае ИЭФ' гели следует предварительно выдерживать в 10%-ной уксусной
кислоте на 50%-ном этаноле для удаления амфолитов-носителей в течение по
крайней мере 45 мин (для гелей толщиной 0,35 мм)< и затем еще 45 мин в
5%-ной уксусной кислоте на 5%-ном ме-
Таблица 3.4. Красители и окрашенные маркеры для электрофореза^
Краситель Индекс цветности <№) X max (поглощение) Применение
Литературный источник
Amido Black 10 В (Buffalo Black, Naphtalene Black 10 В) 20,470 620
Универсальный краситель для белков Wilson, 1973
Coomassie Brilliant Blue R-250 42,660 590 Универсальный
краситель для белков, примерно в 10 раз более чувствительный, чем Amido
black Fairbanks et al., 1971
Coomassie Brilliant Blue G-250 42,655 595 Универсальный
краситель для белков
Alcian Blue 74,240 630 Гликопротеины Wardi, Michos, 1972
Uniblue A 14,552 - Краситель для белков Datyner, Finnimore,
1973
Methylene Blue 52,015 665 РНК, РНКаза Peacock, Dingman, 1967
Methyl Green 42,590 635 Нативная ДНК, кислый или нейтральный
маркер Boyd, Mitchell, 1965
Fast Green FCF 42,036 610 Краситель для белков Gorovsky et al.,
1970
Basic Fuchsin 42,500 550 Гликопротеины Нуклеиновые кислоты и
гликопротеины, богатые сиаловой кислотой Zacharius, Zell, 1969
Dahlberg et al., 1969
Pyronin Y 45,005 510 РНК, кислый маркер Chrambach et al., 1976
Bromphenol Blue - 595 Нейтральный и щелочной маркер Awdeh, 1969
Bromocresol Green - Маркер для электрофореза ДНК в
агарозном геле Me Donnel et al., 1977
Crocein Scarlet 26,905 505 Иммуноэлектрофорез Crowle, Cline,
1977
Xylene Cyanole FF 43,535 Маркер при определении
нуклеотидной последовательности ДНК Maxam, Gilbert, 1977
Toluidine Blue 0 52,040 620 РНК, РНКаза, мукополисахариды
Righetti, Drysdale, 1972
Ethidium Bromide - - Флуориметрия ДНК Sharp et al., 1973
Stains All - - Универсальный краситель для белков Green et
al., 1973
*) Bio Rad Labs. Catalogue G (1981). Замечание: не все перечисленные
Предыдущая << 1 .. 85 86 87 88 89 90 < 91 > 92 93 94 95 96 97 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed