Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
симальная интенсивность окраски достигается за 6 ч. С помощью этого
метода полипептидные зоны окрашиваются четырьмя основными цветами: синим,
зеленым, желтым и красным. Пока еще неясно, чем определяется цвет -
длиной полипептида, аминокислотным составом или же и тем и другим. Анализ
картины окрашивания в публикации Sammons et al., 1981 (рис. 4),
полученный при двумерном фракционировании белков тромбоцитов, наводит на
мысль, что зеленый цвет соответствует основным, относительно
низкомолекулярным полипептидам, однако для окончательного вывода
необходимы дополнительные эксперименты. Набор реактивов для окрашивания
по этой методике поставляется под маркой Gelcode американской фирмой
Upjohn Diagnostics (Kalamazoo, MI).
Мне хотелось бы сделать еще несколько замечаний по поводу метода
окрашивания серебром. Механизм окрашивания до сих пор окончательно не
установлен. Вероятно, основным центром связывания серебра в белках
является амидогруппа пептидной связи. Известно, что при реакции с ионами
серебра в кислой среде амидные протоны могут замещаться на эквивалентное
количество металла. Кроме того, в нейтральных и щелочных растворах,
содержащих какие-либо восстанавливающие агенты (например, альдегиды),
ионы серебра могут восстанавливаться с образованием осадка металлического
серебра. Поэтому при окрашивании, как правило, используются растворы,
содержащие формальдегид. По этой же причине одна из первых методик
окрашивания (Oakley et al., 1980), на первой стадии которой применялась
фиксация белков глутаровым альдегидом, отличалась слишком интенсивным
фоновым окрашиванием. Она была подвергнута критике в работе Boulikas,
Hancock, 1981, где также отмечалось, что предварительная обработка
глутаровым альдегидом сенсибилизирует поверхность геля на участках,
примыкающих к белковым зонам, и развитие окраски происходит слишком
быстро - настолько, что становится практически неконтролируемым.
Невероятно высокую чувствительность метода окрашивания серебром, намного
превосходящую уровень чувствительности обычного колориметрического
анализа, можно объяснить процессом спонтанного роста кристаллов.на
затравках, образовавшихся первоначально на белковой зоне (Switzer et al.,
1979), т. е. реализацией, по сути дела, такого же механизма амплификации,
что и при проявлении экспонированной фотоэмульсии.
Недавно была описана еще одна модификация метода, основанная на
применении метиламина вместо аммиака в растворе нитрата серебра, а также
на принципе "переэкспонирования" с последующим ослаблением до желаемой
интенсивности окрашивания (Marshall, Latner, 1981). По утверждению
авторов,
;.15-1488
226
Глава 3
это позволяет еще более повысить интенсивность окрашивании и избежать
возникновения так называемых "полых" пятен. Образование отдельных "полых"
пятен, или колец, наблюдается* например, при окрашивании по методу
Sammons et al., 1981* при содержании белка более 0,5 мкг на зону. В этом
случае окрашиваются преимущественно края, а центр пятна остается
практически неокрашенным, что вызывает появление ложных двойных пиков при
сканировании (Gorg, Righetti, неопубликованные данные).
Не так давно метод окрашивания серебром удалось применить и для
детектирования нуклеиновых кислот (Boulikas, Hancock, 1981). Этот метод
оказался примерно в 20 раз чувствительнее традиционного метода
детектирования с помощью бромистого этидия; он позволяет регистрировать
до 0,6 нг ДНК на зону.
Применение метода окрашивания серебром при ИЭФ и двумерном
фракционировании белков рассматривается в работах Allen, 1980; Merril et
al., 1979, и Gorg et al., 1981. По-видимому* пока еще рано безоговорочно
заявлять о полном триумфе этого метода; по крайней мере, судя по
результатам исследования Poehling, Neuhoff, 1981, при его использовании
следует проявлять определенную осторожность. Эти авторы пишут следующее:
"Процесс оптимального окрашивания серебром - это шаткий компромисс между
осаждением серебра на белке и развитием фонового окрашивания. Для
разработки воспроизводимой методики окрашивания необходима тщательная
эмпирическая стандартизация множества операций. На сегодняшний день метод
окрашивания серебром (в отличие от СВВ) не позволяет добиться
стехиометрического окрашивания белков. Не наблюдается прямой зависимости
между интенсивностью окраски и содержанием белка в зоне. Чувствительность
метода сильно зависит от конкретного вида белка и нелинейно зависит от
концентрации". Впрочем, такой взгляд на метод оспаривается в работе
Merril et al., 1982. Критический разбор шести вариантов методики
окрашивания серебром дается в работе Ochs et al.* 1981.
3,3.3. Денситометрирование сфокусированных зон
Цилиндрические гели, используемые для ИЭФ, по размеру, как правило,
подходят к обычным сканирующим устройствам в большинстве моделей
спектрофотометров. Для денситометриче-ской оценки содержания белка в
сфокусированных зонах используется такое же оборудование, что и в случае
