Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
Отсутствие щели снимает проблемы, связанные с интерференцией, и сводит к
минимуму геометрические искажения, возникающие, как правило, при
сканировании цилиндрических гелей. Сканирование с помощью лазерного
микропучка позволяет получить картину разделения в виде набора правильных
гауссовых кривых даже при регистрации искаженных зигзагоподобных или
дугообразных зон. Благодаря использованию очень узкого пучка даже близко
расположенные зоны регистрируются Самописцем в виде четко разрешенных
пиков. Так,, полное раз-
f. ¦ и * .-Hi*
ц у 7 V!
?
Wr*10 J
A
^Направление-7 сканирования (ДДС-Na)
/ Б
^Направление-сканирования (ДД C'-Na)
В
у S
S
Ct ос
gl
X § а> э
со 2 та а
i
-.4
•г
*Х-, Н
I1' . * .
t" •- *
* l t f 'и.m I 1 ¦
L •*.
Ъ -* i
с e
Q-D
.M
? 3
, q Ю
4л U;|3
-Направление- ? сканирования (ДДС -Na)i
Рис. 3.22. Один из вариантов компьютерного анализа двумерных электрофоре-
грамм. А. Флюорограмма геля после двумерного фракционирования меченых
белков конфлюэнтной культуры клеток В 103. В первом направлении
проводилось ИЭФ в диапазоне pH 6-8, во втором - электрофорез в ДДС-Na в
7,5%-ном ПААГ. Для упрощения картины проиллюстрирован процесс обработки
небольшого участка геля размером 36x53 мм, обычно же сканируют площадь
150X150 мм. Минимальное необходимое для регистрации содержание
радиоактивного материала в пятне - 0,5 имп./мин. На изображении,
полученном при первичной машинной обработке, белковые пятна представлены
в виде крестов, размер которых в каждом случае пропорционален суммарному
поглощению в индивидуальном пятне. Б. Линии, полученные при
последовательном сканировании изображения на рис. А. Каждая линия
строится по данным примерно 380 независимых измерений поглощения, которые
поступают на ЭВМ и обрабатываются непосредственно на стадии анализа
линий. Расстояние между линиями соответствует шагу в 280 мкм в
направлении дискретного смещения луча сканирующего устройства (по оси
pH). В, Анализ линий. По заданной программе на каждой линии делаются
специальные пометки, указывающие, каким образом проводилась обработка
данных. Каждый пик заключается в скобки, центр пика помечается
вертикальной чертой. Показаны линии 20-59 с рис. Б, разнесенные на
большее расстояние друг от друга. Г. Преобразование в дискретные зоны.
Пики, зарегистрированные при анализе линий, трансформируются в дискретные
зоны, образуемые небольшими параллельными отрезками соответствующих
линий. Длина каждого отрезка пропорциональна интенсивности на данном
участке пика. Центр отрезков помечен вертикальной чертой, касающейся
следующего параллельного отрезка, так что все отрезки, входящие в данную
дискретную зону, оказываются объединенными общей центральной линией.
Пронумерованные зоны затем интегрируются в пики суммарной интенсивности,
площадь каждого из которых рассчитывается на завершающем этапе обработки
(не показано). (Garrels,
1979.)
230
Глава 3
решение двух соседних зон может достигаться при расстоянии между ними
всего лишь 80 мкм. Как утверждается в работе Zeineh et al., 1975, при
необходимости разрешающую способность современных сканирующих лазеров
можно повысить с помощью некоторых модификаций до нескольких сотен
ангстрем. В настоящее время одно из лазерных сканирующих устройств
выпускается фирмой LKB Produkter АВ (2202 Ultro Scan).
При двумерном разделении белков (аналогично методу О'Фаррелла)
денситометрирование гелей оказывается нелегкой задачей. В этом случае
каждое белковое пятно должно характеризоваться тремя параметрами - pi
(координатой по оси х), Мг (координатой по оси у) и относительной
интенсивностью (в %). Пожалуй, эта задача лишь ненамного легче, чем
составление астрономических карт, которое требует введения четвертой
координаты. На рубеже веков гарвардский астроном Пикеринг решал подобную
задачу с помощью наемных "компьютеров" (Ferris, 1979). Он платил по 25
центов в час женщинам, которые должны были усердно покрывать чистые
страницы журналов многочисленными колонками цифр. Ошибаться не
позволялось! Сегодня, в условиях расцвета феминистского движения и
широкого использования ЭВМ, такой подход к проблеме показался бы, мягко
говоря, экстравагантным. Программы для регистрации и анализа результатов
двумерного фракционирования в геле с помощью компьютера были независимо
предложены несколькими группами исследователей (Garrells, 1979; Bossinger
et al., 1979; Kronberg et al., 1980; Taylor et al., 1980; Lutin et al.,
1977; Alexander et al., 1980; Capel et al., 1979; Klose et al., 1980). На
рис. 3.22 в качестве примера приведен один из вариантов компьютерного
анализа картины двумерного разделения белков в геле. Белковые пятна на
флюорограмме, радиоавтограмме или электрофореграмме, окрашенной кумасси
синим, преобразуются в кресты (А), размер которых пропорционален
суммарной интенсивности данного пятна. Эти кресты в свою очередь
трансформируются в "силовые линии" сканирования (Б), которые при
