Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
геле составляет в ¦среднем порядка 20 мМ (Righetti, 1980), то, как
правило, можно достаточно легко изменить pH с помощью 100-200 мМ буферных
растворов. Различные способы изменения неблагоприятного pH в геле после
ИЭФ обсуждаются в работах Wadstrom, Smyth, 1975а, и Gianazza et al.,
1980.
В отдельных случаях в процессе ИЭФ может происходить инактивация
ферментов за счет хелатирования амфолитами необходимых для активности
ионов металлов. Так, было обнаружено, что при продолжительном
фокусировании щелочной фос-фатазы теряется около 90% активности (Latner
et al., 1970), правда, ферментативная активность в значительной степени
восстанавливается при последующей инкубации с ионами цинка. Некоторые
осложнения при ИЭФ ферментов иногда возникают из-за анодного окисления
или катодного восстановления, однако эти проблемы удается разрешить,
добавляя соответствующие компоненты к растворам электролитов (разд. 4.2).
При ИЭФ в градиенте плотности некоторые антиоксиданты можно вводить
непосредственно в рабочий раствор. Однако многие из них ингибируют
полимеризацию акриламида, поэтому при ИЭФ в
Изоферменты ЛДГ
Сердце 13-дневиого "куриного зародыша
Ж
УШ.:. vie
ш
Сердце взрослой курицы
...
ШЖ'Ш:
культура ткани ^ {сердца 13-дневного ;г: |куриного зароды ша
Рис. 3.23. Гистохимическое окрашивание изоферментов лактатдегидрогеназы
<ЛДГ) после ИЭФ в цилиндрических гелях фракций надосадочной жидкости
неочищенного гомогената тканей сердца курицы. ИЭФ проводилось в диапазоне
pH 3,5-10 (Righetti, Drysdale, 1973).
Аналитическое ИЭФ
ПААГ их приходится вводить в уже готовый гель или добавлять к электродным
растворам.
Помимо методов прямого гистохимического окрашивания с использованием
низкомолекулярных реагентов для обнаружения ферментов применяется метод
зимограмм. В этом методе на гель после ИЭФ накладывают другой гель, в
состав которого могут быть включены высокомолекулярные субстраты и другие
реагенты. Метод зимограмм наиболее эффективен при обнаружении белков в
плоских гелях. С его помощью удается обнаруживать ряд протеолитических
ферментов. Для выявления сфокусированной в плоском геле стафилокиназы
использовался сгусток фибрина в смеси с плазминогеном. Стафилокиназа
активирует плазминоген в плазмин, благодаря фибринолитическому действию
которого в слое непрозрачного сгустка фибрина образуются прозрачные
пятна, соответствующие локализации зон стафилокиназы в геле (Vesterberg,
Eriksson, 1972). Для выявления стафилококковой протеиназы после ИЭФ
использовался агаровый гель, содержащий казеин (Arvidson, Wadstrom,
1973),. а для обнаружения сфокусированного пепсина - агаровый: гель,
содержащий альбумин (Vesterberg, 1973b). В этих случаях ферментативная
активность обнаруживается по появлению прозрачных зон на голубом фоне
(рис. 3.24) после обработки агарового геля обычными белковыми красителями
(Wadstrom,. Smyth, 1975b). В табл. 3.9 и 3.10 перечислены примеры исполь-
Рис. 3.24. Зимограмма протеиназ из Serratia liquetaciens (S. I.) и
Serratia-marcescens (S. т.) в агаре, содержащем казеин. После ИЭФ в
пластине ПААГГ на него накладывают пластину казеин-агарового геля. Слева
направо: S. I... штамм 2; S. L, штамм 3; S. /., штамм 26; S. т., штамм 6;
S. т., штамм 7; S. т., штамм 8; S. т., штаммм 10; S. т., штамм 11.
(Wadstrom. Smyth, 1975b.),
16*
Таблица 3.9. Применение метода зимограмм с использованием
низкомолекулярных субстратов в сочетании с ИЭФ
Фермент
Субстрат в хромофор
Литературный источник
. Алкого льдеги др оген аза Ацетальдегиддегидро-геназа P-N-ацетилглкжоза-
минидаза Т^-ацетил-Р-Э-гексоза-минидаза
-Г алактозо-1 -фосфат-уридилтрансфераза
Глиоксалаза I .р-Глюкуронидаза
NAD/NADP-дегидро-
геназа
NADH-диафораза
Карбоангидраза Катехолоксидаза Кислая фосфатаза Креатинфосфокиназа
Лактатдегидрогеназа
Липоксидаза
Нейраминидаза
Оксидаза L- и D-аминокислот Пептидаза А
Лероксидаза6)
Спирт/ЫАЭ/ФМС/МТТ1) Ацетальдегид/NAD/ /ФМС/МТТ Метилумбеллиферил-
гликозиды Нафтол-AS-BI-N-aue-тил-Р-О-глюкозамин/ /Быстрый гранатовый GBC,
диазониевая соль2)
Уридин-5'-дифосфо-1 -а--D-глюкопиранозид/ /Галактозо-1 -фосфат/
Фосфоглюкомутаза/
/Г люкозо-б-фосфатде-гидегрогеназа/NADP Метилглиоксаль/Г лута-тион/ДХИФ3)
/МТТ1 * 8-оксихинолин-Б-гдюку-ронид/Быстрый черный К4\ диазониевая соль
Субстрат/NAD-NADP/
/ФМС/Тетразолиевая
соль
КАПН/ДХИФ3>/МГП>
4-метилумбеллиферил-ацетат 4-метилкатехол/п-Фени-ленд намин 4-
метилумбеллиферил-фосфат Креатинфосфат/ФМС!)/ /гх-Нитротетразолие-вый
голубой5>
Л актат/ФМС/МТТ1 >
Линолевая кислота/К1 2- (3-метоксифенил) -N-ацетилнейраминовая кислота L-
Leu или Р-РЬе/ФМС^/ /Трифенилтетразолий Пептид/Оксидаза L-ами-
нокислот/Аминоэтил-карбазол/Пероксидаза Уреопероксид/Г уайакол или о-
толуидин и ме-зидин
Harada et al., 1978b Harada et al., 1978a
Leaback, Robinson, 1974
Hayase et al., 1973
Schapira et al., 1979
Komph et al., 1975; Kuhnl et al., 1977a Coutelle, 1971
Humphryes, 1970
Tariverdian et al., 1970 Edwards et al., 1979; Fisher et al., 1977
