Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
специфических методов окраски можно обнаружить белки, содержащие такие
кофакторы или простетические группы, как гем или производные флавина.
Дополнительные возможности окрашивания появляются при работе со сложными
белками. Так, липопротеины, как и обычные липиды, можно обнаружить с
помощью краси-
240
Глава 3
теля Sudan black. В (Kostrier et al., 1969), а гликопротеины - с помощью
типичного для углеводов метода окрашивания, основанного на окислении
йодной кислотой с последующим образованием шиффовых оснований, без
предварительного удаления амфолитов (Catsimpoolas, Mayer, 1969). Белки,
образующие специфический комплекс с определенными лигандами, выявляются
посредством инкубации геля после ИЭФ в растворе соответствующего
радиоактивного лиганда. Так, конканавалин А можно обнаружить с помощью
[а-14С]-метил-0-глюкозида, внутренний фактор Касла из желудочного сока -
с помощью [14С]-цианокобаламина, а тироксинсвязывающий белок - с помощью
[1251] -тироксина. В работе Keck et al., 1973а, описан интересный способ
детектирования иммуноглобулинов. После ИЭФ гель обрабатывают глутаровым
альдегидом, при этом образуются меж-молекулярные сшивки, благодаря
которым сфокусированные зоны фиксируются в геле. Эти зоны удается
обнаружить по связыванию с соответствующими антигенами, содержащими
радиоактивную или флуоресцентную метку. В табл. 3.8 перечислены некоторые
распространенные методы специфического окрашивания, применяемые при ИЭФ.
После ИЭФ многие белки удается обнаружить по их биологической активности.
По многим критериям можно считать, что ИЭФ является одним из самых
щадящих методов фракционирования ферментов. Хотя разделение проходит в
бессолевой среде, присутствующие поливалентные амфолиты-носители
оказывают стабилизирующее или защитное действие на больший-* ство белков
и помогают .удерживать их в растворе. В отдельных случаях стабилизирующее
влияние амфолитов оказывается выше, чем у неорганических солей, как это
было показано для а-гемолизина, протеазы и гексозаминидазы (Vesterberg et
al., 1967). Иногда стабилизация амфолитами бывает обусловлена их
хелатирующим эффектом в отношении ионов тяжелых металлов, таких, как
Cu2+, Hg2+ и РЬ2+, которые оказывают ингибирующее действие на некоторые
ферменты. Используя соответствующие методы гистохимического окрашивания,
удается обнаружить многие ферменты. На рис. 3.23 показан профиль
разделения изоферментов лактатдегидрогеназы из тканей сердца курицы. Хотя
эти ферменты составляют весьма незначительную часть от суммарного белка
тканевых экстрактов, их удается легко зарегистрировать по биологической
активности. В данном случае активность ферментов обнаруживалась по
восстановлению пиримидиновых нуклеотидов, которым сопровождается процесс
ферментативного окисления молочной кислоты. Восстановленные нуклеотиды в
свою очередь выявляются благодаря образованию тетразолиевых солей, дающих
водонерастворимый окрашенный осадок. Естественно, что в тех случаях,
когда pH
Аналитическое ИЭФ
Таблица 3.8. Некоторые специфические способы в геле после ИЭФ
обнаружения образцов
Образец Способ обнаружения Литературный источник
Трансферрин
Апотрансферрин
Церулоплазмин
Гаптоглобнны
Липопротеины
Ферритин
Гликопротеины
Иммуноглобулины
Негистоновые белки хроматина Конканавалин А РНК
Пептиды
Гемопексин Гепарин Тироксинсвязы-вающий белок Внутренний фактор Касла (из
желудочного сока)
2,4-динитрозо-1,3-нафталиндиол (Fe3+ восстанавливается гидрохиноном)
Ре3+-нитрилотриацетат
n-Фенилендиамин (оксидазная активность) Гемоглобин/беизидин/НгОг (перок-
сидазная активность)
Краситель Oil Red в 61%-ном этаноле Краситель Sudan Black В
Реакция образования берлинской лазури
Окисление перйодатом и образование шиффовых оснований (PAS stain)
Фиксирование глутаровым альдегидом и детектирование с помощью
а) 1251-меченых антигенов
б) антигенов с флуоресцентной меткой
в) меченого белка А из S. aureus
Введение метки 32Р
а-Метил-D-глюкоз нд Толуидиновый синий, метиленовый синий или акридиновый
оранжевый Предварительная окраска динит-рофторбензолом Связывание гема
Толуидиновый синий ?1311] -тироксин
[МС] -цианокобаламин
Latner, 1973
Hovanessian, Awdeh,.
1975 Latner, 1973
Latner, 1973
Latner, 1973
Kostner et al., 1969 Godolphin, Stinson* 1974 Drysdale, 1970
Hebert, Strobbel, 1974 Keck et al., 1973a -
McGillivray, kick-
wood, 1974 Akedo et al., 1972 Drysdale, Righetti,
1972
Kopwillem et al., 1973
Latner, Ernes, 1975 Nader et al., 1974 Latner, Ernes 1975
Latner,J973
области фокусирования ферментов значительно отличается от pH-оптимума их
каталитического действия, приходится принимать специальные меры для того,
чтобы перекрыть буферную емкость амфолитов. Как правило, этого удается
достичь, инку-
16-1488
.242
Глава 3
бируя гель непосредственно с субстратом в концентрированном ¦буферном
растворе или проводя быструю предварительную обработку геля буфером с
соответствующим значением pH. Поскольку молярность 2%-ных амфолитов в
