Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
прежнем уровне. Мы подчеркиваем, что для удачного замораживания яиц или
эмбрионов необходимо следовать только одной прописи. В табл. 13.1 описана
методика, которой пользуются двое из нас (М. В. и Д. У.) для
замораживания ооцитов и эмбрионов.
3.1. Приготовление образца
3.1.1. Выбор среды для замораживания
Чтобы яйца и эмбрионы не повредились в результате длительных воздействий
неконтролируемых изменений pH среды, забуференной СОг, материал следует
собирать и замораживать в средах со стабильным pH (от 7,2 до 7,4) в
воздухе.
Перечень обычно используемых сред:
а) простой физиологический раствор (PBS);
б) забуференный фосфатом солевой раствор Дульбекко (РВ1: [14], табл.
13.2);
в) эмбриональная культуральная среда, забуференная HEPES (М2: [15]; табл.
13.2, см. также гл. 2, разд. 5.2).
22*
328
Глава 13
Таблица 13.2. Состав сред для замораживания ооцитов и эмбрионов
РВ1 М2
Компонент г/л мМ г/л | мМ
NaCl КС1 СаС12-2Н20 КН2Р04 MgCl2-6H20 Na2HP04-12H20 MgS04-7H20 NaHC03
HEPES1" Пируват Na2" Лактат Na3" Глюкоза БСА4" Пенициллин G (соль калия)
Сульфат стрептомицина Феноловый красный 8000 0,200 0,132 0,200 0,100
2,898 0,036 1,000 3,000 0,060 0,010 136,87 2,68 0,90 1,47 0,49 8,09
0,33 5,56 5,533 0,356 0,252 0,162 0,293 0,349 4,969 0,036 2,610 1,000
4,000 0,060 0,050 0,010 94,66 4,78 1,71 1.19 1.19 4,15 20,85 0,33
23,28 5,56
') Calbiochem-Boehring: Ultrol.
2) Calbiochem-Boehring.
3) Sigma grade DL, 60%-ный сироп.
4) Кристаллический: Miles-Serovac.
Среды РВ1 и М2 обогащены пируватом, глюкозой и БСА; М2, кроме того,
содержит лактат. Эти источники энергии предотвращают истощение
метаболических пулов в эмбрионах в процессе сбора.
3.1.2. Выбор и подготовка контейнере дпя образцов
Ооциты и эмбрионы можно замораживать в фиалах с завинчивающейся пробкой
(Nunc, Kamstrup, Дания), в стеклянных тест-пробирках (диаметром 10 мм,
длиной 75 мм; Arthur
Н. Thomas Co., Philadelphia, США), в боросиликоновых стеклянных
ампулах (на 1-2 мл, Wheaton Scientific, Millville, США) или в пластиковых
соломинках (пайетах) (IMV, L'Aigle, Франция). Чтобы облегчить загрузку,
интактные кумулюсные массы часто замораживают в стеклянных тест-
пробирках. Надежная процедура замораживания эмбрионов в пайетах описана в
работе [16]. Мы предпочитаем пользоваться стеклянными ампулами на 2 мл и
замораживать ооциты и эмбрионы, свободные от кумулюса. При этом мы
руководствуемся следующими соображениями.
1. Выживаемость эмбрионов, замороженных в стеклянных пробирках или
ампулах, выше, чем у эмбрионов, заморо-
Низкотемпературная консервация яиц и эмбрионов мыши____________329
женных в пластиковых фиалах (по-видимому, это связано с лучшей
теплопроводностью стекла).
2. Стеклянные ампулы можно запаивать, чтобы предотвратить внесение
дебриса, накапливающегося при хранении в ЖА. Учтите, что силиконовые
пробки, которыми пользуются для закрывания пластиковых пробирок, легко
теряются.
3. Вероятность случайного нагревания образца сравнительно большого
объема, который содержится в ампуле, ниже, чем при использовании пайеты
(ср. объемы: 0,2-0,3 мл и 20-40 мкл).
4. Большой объем ампулы (по сравнению с пайетой) упрощает маркировку и
последующую идентификацию образцов.
Среди недостатков стеклянных ампул отметим следующие:
а) при хранении плохо запаянных ампул в них может попасть ЖА, при
размораживании ампул он начнет испаряться, что в свою очередь может
привести к взрыву;
б) в сосуд с ЖА можно загрузить сравнительно небольшое число ампул.
Судя по нашему опыту, мыть ампулы не обязательно: следы детергента на
стекле могут послужить причиной гибели эмбрионов. Перед стерилизацией
маркируйте каждую ампулу специальными чернилами по стеклу (Gurr).
Достаточно использовать простой числовой код. Дайте чернилам высохнуть,
стерилизуйте ампулы нагреванием при 150 °С в течение 90 мин.
Постоянными кодовыми номерами пользуются при длительном хранении, но их
трудно разобрать на замерзшем стекле. Чтобы упростить последующую
идентификацию, непосредственно перед загрузкой ампулы мы прикрепляем к
ней клейкую метку, наподобие тех, которыми пользуются электрики, чтобы
различать провода (маркеры проводов; W. Н. Brady and Co. Ltd, UK).
3.1.3. Подготовка образца для охлаждения
1. Воспользовавшись имеющейся инъекционной иглой (калибр 19, длина 50
мм), внесите в маркированную ампулу 0,15 мл среды М2.
2. Поместите пипеткой эмбрионы в среду (около 30 на образец). Прежде чем
захватить их в пастеровскую пипетку с оттянутым кончиком, втяните 1-2
пузырька воздуха, затем возьмите эмбрионы в наименьшем объеме среды М2.
Опустив конец пипетки в среду М2 в ампуле, осторожно выпускайте эмбрионы,
пока не выйдет пузырек воздуха. Проконтролируйте под микроскопом, все ли
эмбрионы вышли из пипетки.
330
Глава 13
3. Охладите образцы до 0 °С в ледяной бане до внесения криопротектора
(разд. 3.2.3).
3.2. Криопротектор
Присутствие криопротектора во время охлаждения необходимо для выживания
эмбрионов. Механизм действия таких соединений не совсем понятен, но можно
