Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
стадии, дошли до момента родов и родились все шесть, из них два оказались
явно химерными (судя по окраске шерсти и типу глюкозофосфатизо-меразы
крови), один полностью типа CFLP, три относились к типу F2.
3.5. Кариопласты с минимальным количеством цитоплазмы
Если требуются ядра или пронуклеусы, практически лишенные цитоплазмы, в
частности, для биохимического анализа, они могут быть приготовлены в виде
кариопластов с минимальным объемом цитоплазмы. Существуют два способа
уменьшения объема цитоплазмы, следующей за ядром в энуклеационной
.пипетке.
1. Сделайте так, чтобы ядро выступило из кончика пипетки, а затем
проведите эту пипетку через границу разделения среда/масло, пока
кариопласт не оторвется от цитоплазмы, оставшейся в пипетке.
2. Введите часть кончика энуклеационной пипетки в конец удерживающей
пипетки, немного выпустите ядро из энуклеационной пипетки, а затем к
обеим пипеткам приложите небольшое отрицательное давление; кариопласт
разорвется сразу позади ядра. Эти приемы более эффективны в случае
больших излишков цитоплазмы, чем в случае малых кариопластов. Описанные
операции позволяют по-
Рис. 12.7. Пронуклеопласты. Мужские пронуклеусы с минимальным количеством
цитоплазмы, извлеченные из оплодотворенных яиц.
Трансплантация ядер в яйца
319'
лучить кариопласты, в которых цитоплазма составляет 10% общего объема, но
чем мельче ядра, тем труднее получить это соотношение (рис. 12.7).
3.6. Разделение яиц
В тех случаях, когда обработка яиц цитохалазином или другими ядами
нежелательна и требуются крупные кариопласты^ их можно получить, оперируя
освобожденные от блестящей оболочки яйца (гл. 2, разд. 3.2.1) в висячей
капле РВ1 (гл. 13, разд. 3.1.1). Для операции потребуется большая пипетка
типа присоски с внутренним отверстием около 40 мкм в диаметре и сплошная
стеклянная игла диаметром 10-12 мкм с тупым оплавленным концом (см. гл.
3, разд. 9.3); оба инструмента должны быть изготовлены из
силиконированной капиллярной трубки, обработаны NP-40 и хорошо отмыты.
Яйцо осторожно' втягивают в удерживающую пипетку и снова выпускают,
вследствие чего оно принимает удлиненную форму; сплошную иглу помещают
поперек яйца в месте предполагаемого разделения и опускают через границу
среда/масло [15]. Тем же способом можно удалить одно полярное тельце или
оба. Степень выживаемости яиц, оперированных в РВ1, ниже, чем
оперированных в PNC, но не настолько, чтобы этой средой нельзя было
пользоваться.
4. Оценка результатов
Частота слияния во многом зависит от качества препарата вируса Сендай.
При хорошем качестве препарата и соблюдении-всех условий частота слияния
превышает 90%. Если реконструкция яйца осуществилась, с ним можно
обращаться как с любым другим яйцом. Такие яйца можно культивировать in
vitro для изучения предимплантационного развития (см. гл. 2) или
перенести псевдобеременным реципиентам для наблюдения над развитием in
vivo. Эмбрионы 1-, 2- или даже 4-клеточной стадии могут быть перенесены в
яйцеводы реципиента 1-го дня, а на стадии поздней морулы/ранней
бластоцисты - в матку реципиента 3-го дня (см. 13, разд. 6.4.6). (При
этом рекомендуется в другой яйцевод или рог матки перенести нормальный
эмбрион для контроля эффективности псевдобеременности и оценки
индивидуальных различий.) Реконструированные яйца можно использовать при
получении агрегационных химер или при конструировании бластоцист [16], а
также для анализа белков и ферментов (см. гл. 6-8) или хромосом (см. гл.
5).
Развитие диплоидных партеногенетических, гиногенетичес-ких или
андрогенетических эмбрионов после их переноса псев-
320
Глава 12
добеременным реципиентам редко продолжается дольше 10 или 11 дня [17-20].
На этой стадии их морфологическая организация в большей или меньшей
степени аномальна, но ткани живы и достаточно здоровы, чтобы быть
объектом биохимического анализа. Анализ эмбрионов, прошедших половину
срока беременности, описан в гл. 3. Химеры, полученные комбинацией
аномальных эмбрионов с нормальными, предоставляют возможность анализа на
поздних стадиях беременности или после рождения.
5. Перспективы и ограничения техники трансплантации ядер яиц
млекопитающих
Несмотря на некоторые успехи в применении вирусов и химических соединений
(полиэтиленгликоль, ПЭГ), в качестве агентов, вызывающих слияние [21,
22], следует признать, что их использование в экспериментах на яйцах
млекопитающих имеет некоторые существенные ограничения. Мы обнаружили,
что ПЭГ, наиболее широко используемый химический фузоген соматических
клеток, очень ненадежен в исследованиях на ранних эмбрионах. Его
активность может варьировать, кроме того, он способен вызывать
интенсивный лизис и препятствовать развитию, поскольку с трудом удаляется
с плазматической мембраны.
Несмотря на то, что вирус Сендай оказался более удачным фузогеном для яиц
млекопитающих, применение и этого агента имеет ряд недостатков. Всегда
существует риск, хотя и незначительный, что некоторые вирусные частицы в
