Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 126

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 120 121 122 123 124 125 < 126 > 127 128 129 130 131 132 .. 162 >> Следующая

Неоплодотворенные или оплодотворенные яйца и эмбрионы на стадиях
дробления получают в результате стимуляции овуляции у мышей инъекциями
ГСЖК и чХГ (см. гл. 1, разд. 5.4). Данных о том, что предварительная
гормональная стимуляция самок-доноров может повлиять на жизнеспособность
яиц после замораживания и оттаивания, нет. Однако известно, что некоторые
линии мышей устойчивы к стимуляции гонадотропином, в таких случаях
оплодотворенные яйца и эмбрионы собирают от половозрелых самок,
овулировавших естественным путем. Известно также, что у большинства
гибридных самок Fi происходит надежная суперовуляция. Таким образом, в
тех случаях, когда генетический фон не имеет значения, затруднения с
индукцией суперовуляции можно обойти, спаривая чувствительных к
гонадотропину гибридных самок Fi с самцами, несущими нужный ген.
2.2. Сбор ооцитов и эмбрионов
Для освобождения недавно овулировавших ооцитов из яйцевода между 13 и
14,5 ч после инъекции чХГ стенки ампулы разрывают глазным пинцетом (см.
гл. 2, разд. 2.1.1). Ооциты замораживают либо в интактных кумулюсных
массах, либо после удаления клеток кумулюса гиалуронидазой (гл. 2, разд.
2.1.1). В последнем случае их следует собрать и отмыть от фермента до
того, как они будут помещены в пробирки для замораживания.
22-171
326
Глава 13
Оплодотворенные яйца и эмбрионы на стадиях дробления вымывают из
репродуктивного тракта через определенные интервалы времени после
овуляции или инъекции чХГ (гл. 2, разд. 2.2). Эмбрионы всех стадий
собирают в РВ1 или среду М2 (разд. 3.1) для замораживания или в среды
РВ1, М2 или НВ1 (разд. 4.1) для витрификации.
3. Замораживание
Образование большого количества льда в любой клетке млекопитающих
является основным фактором, приводящим к ее гибели при оттаивании.
Причиной летального исхода может быть как механическое повреждение клетки
кристаллами льда, так и осмотический шок в результате образования или
таяния льда. Поэтому успех замораживания яиц и эмбрионов зависит от
степени обезвоживания клеток, препятствующей формированию
внутриклеточного льда.
Удаление воды из клеток производится одним из двух способов.
1. При субнулевых температурах: во время образования льда в суспензионной
среде концентрация внеклеточных растворов возрастает, давление паров воды
внутри клетки становится выше, чем снаружи, и вода устремляется из клетки
через мембрану для установления равновесия.
2. Перед охлаждением до субнулевых температур: прибавление раствора
сахарозы к суспензионной среде приводит к частичному обезвоживанию
бластомеров. Этот способ удаления воды можно сочетать с выдерживанием при
относительно высоких субнулевых температурах (обычно около -30 °С) (для
дальнейшей потери воды) перед быстрым охлаждением до -196 °С [11].
Возможен также перенос эмбрионов из комнатной температуры прямо в жидкий
азот [12].
Процедуры, связанные с применением непроникающих растворов для
обезвоживания эмбриона перед охлаждением, относительно новы и
недостаточно опробованы. Будущее покажет, будут ли они включены в
стандартный метод создания банка эмбрионов. С другой стороны, постепенное
обезвоживание в процессе медленного охлаждения с успехом используется на
протяжении последних 14 лет во многих лабораториях. Описанные здесь
методы основаны на процедурах охлаждения, разработанных для консервации
эмбрионов Уиттингхэмом, Лейбо и Мейзуром [1] и Уилмутом [2], а также на
модификациях их методик [13]. Важнейшие характеристики данных методов:
1) выбор суспензионной среды;
2) присутствие криопротекторов в процессе охлаждения;
Низкотемпературная консервация яиц и эмбрионов мыши____________327
Таблица 13.1. Схема опыта по замораживанию - оттаиванию ооцитов
и эмбрионов
1. Маркируйте ампулу и стерилизуйте ее нагреванием (разд. 3.1.2).
2. Внесите 0,15 мл среды (разд. 3.1.1.) в ампулу (разд. 3.1.3).
3. Внесите пипеткой ооциты/эмбрионы в ампулу (разд. 3.1.3).
4. Охладите образец до 0 °С.
5. Через 10 мин добавьте. к образцу 0,15 мл 3 М ДМСО (разд. 3.2.3).
6. Через 15 мин перенесите ампулу в баню для сидинга (разд.
3.3.1) при
-6°С.
7. Через 2 мин индуцируйте процесс кристаллизации (сидинг).
8. Через 5 мин перенесите образцы с образовавшимся льдом в
охлаждаю-
щую баню (разд. 3.4.2) при -6 °С.
9. Охлаждайте со скоростью ~0,5°С/мин до -40 °С либо ниже -70 °С до
помещения ампулы в ЖА (разд. 3.4.3).
10. Отогревайте образцы с соответствующей скоростью (разд. 3.5).
11. Разведите ДМСО (разд. 3.6).
3) индукция образования льда (сидинг) при температуре ниже точки
замерзания среды;
4) медленное охлаждение (-0,5°С/мин), заканчивающееся при -40 °С или при
температурах ниже -70° в результате погружения в жидкий азот (ЖА);
5) хранение при -196 °С в ЖА;
6) осторожное удаление криопротектора после оттаивания для предотвращения
осмотического шока.
Факторы, влияющие на выживание, взаимозависимы, и изменение одного из них
создает необходимость изменения остальных, чтобы выживаемость осталась на
Предыдущая << 1 .. 120 121 122 123 124 125 < 126 > 127 128 129 130 131 132 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed