Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
распоряжении обширный набор мутантных, инбредных и сингенных линий мышей.
Однако получение и поддержание таких линий обходится дорого и требует
больших затрат времени. Наличие банка эмбрионов нужных генотипов
позволяет не опасаться случайной утраты ценного генетического материала в
результате ошибок скрещивания, генетических контаминаций или болезней и
дает возможность обойтись без дорогостоящего содержания животных, не
требующихся в данное время. Более того, упрощаются международные
перевозки: транспорт эмбрионов дешевле и гуманней, чем транспорт
животных. Важно также, что число болезней, переносчиками которых могут
быть эмбрионы, ниже, чем соответствующий показатель для животных. Это
делает менее жесткими карантинные ограничения.
Криоконсервация эмбрионов человека имеет особое значение в связи с
проблемой бесплодия. Методы стимуляции овуляции и оплодотворения in vitro
дают возможность получить большее число эмбрионов, чем может быть
немедленно имплантировано матери. Консервация дополнительных эмбрионов
для переноса в последующих циклах повышает возможность удачной
беременности. Хранение неоплодотворенных яйцеклеток позволяет обойти
правовые и этические ограничения, связанные с консервацией эмбрионов
человека. Замороженные яйцеклетки могут оказаться совершенно
необходимыми, если женщина утрачивает нормальную функцию яичников. Однако
следует подчеркнуть, что убедительные доказательства безопасности
хранения получены только для замороженных эмбрионов, в отношении яиц,
консервированных при -196 °С, таких данных нет.
1 М. J. Wood, D. G. Whittingham. MRC Experimental Embryology and
Teratology Unit, Woodinansterne Road, Carshalton, Surrey SM5 4EF, UK. №.
F. Rail. Rio Vista International, Route 9, Box 242, San Antonio TX78227,
USA.
21* 323
324
Глава 13
Метод консервации мышиных эмбрионов путем медленного охлаждения (0,2-
2°С/мин) в присутствии диметилсульфоксида (ДМСО) и медленного оттаивания
(4-25°С/мин) [1,2] вскоре стал применяться для ооцитов мыши [3] и
эмбрионов других видов, включая человека [4, 5]. По мере того как
создание банков эмбрионов становилось частью повседневных
медикобиологических исследований и практического животноводства, в
методику был внесен ряд модификаций. В настоящее время в мировой практике
используется несколько вариантов, подразумевающих применение разных
криопротекторов, менее длительных процедур охлаждения и быстрого
оттаивания. К сожалению, ни в одном случае сравнительный анализ различных
модификаций методики замораживания не производился, поэтому мы не можем
судить о преимуществах той или иной процедуры. Не так давно живое
потомство из эмбрионов мыши удалось получить в результате их консервации
при -196°С без образования льда, т. е. не путем замораживания, а путем
витрпфика-ции (превращения эмбрионов в "стеклянные") [6]; в настоящее
время разрабатываются различные модификации этой методики [7, 8].
Мы ограничимся описанием:
1) методов, используемых для замораживания ооцитов и эмбрионов в нашей
лаборатории (они были разработаны в расчете на простые и недорогие
приборы, однако вполне пригодны и для работы с современными
биологическими замораживателями);
2) метода витрификации, который позволяет нам получать живых эмбрионов
(правда, с меньшей степенью выживаемости, чем прн использовании
стандартной техники замораживания).
Компетентное обсуждение теоретических аспектов замораживания эмбрионов
можно найти в работах [4, 9 и 10].
2. Стадии развития
Эмбрионы всех предимплантационных стадий развития мыши после
замораживания при -196 °С дают живое потомство. Между тем после
витрификации только 8-клеточные эмбрионы [6], морулы и ранние бластоцисты
[7] способны продолжать развитие до поздних плодов или живорожденного
потомства.
Существует несколько причин, по которым для хранения предпочтительно
использовать эмбрионы именно 8-клеточной стадии развития.
1. Они менее чувствительны к манипуляциям in vitro, чем эмбрионы 1- и
2-клеточной стадии.
Низкотемпературная консервация яиц и эмбриоион мыши
325
2. Их способность к дальнейшему развитию хорошо коррелирует с
морфологией. Ранние аномалии легко выявляются и все эмбрионы, отстающие в
развитии или фрагментирующиеся, сразу отбрасывают.
3. Процедура их замораживания несколько упрощена по сравнению с таковой
для бластоцист.
4. В случае повреждения одного или двух бластомеров оставшиеся могут
обеспечить развитие жизнеспособного плода.
5. Культивирование in vitro в течение 24 ч оттаявших эмбрионов позволяет
отобрать те из них, которые возобновили дробление, и использовать их для
переноса псевдобеременной самке.
Замороженные неоплод отворенные яйца мыши могут служить моделью 1) для
разработки методов консервации ооцитов человека; 2) для изучения
клеточной реакции на низкие температуры; кроме того, их можно
использовать для оплодотворения in vitro в тот момент, когда это удобно
исследователю.
2.1. Источник ооцитов и эмбрионов
