Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 122

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 116 117 118 119 120 121 < 122 > 123 124 125 126 127 128 .. 162 >> Следующая

затем прочно захватите яйцо удерживающей пипеткой. На этот раз не
обязательно фиксировать яйцо в районе полярного тельца.
11. Пройдите пипеткой через блестящую оболочку и захватите небольшой
фрагмент цитоплазмы; отщипните от яйца этот цитопласт. Он будет выступать
в роли буфера.
12. Извлеките мужской пронуклеус. При вхождении в энуклеационную пипетку
ядерная мембрана может слегка деформироваться. Это не повредит ядро, но,
если пипетка слишком узка или просвет кончика ограничен прилипшими
капельками масла или частицами дебриса, некоторые ядрышки могут
сдвинуться в мембране и выскользнуть из нее. В таком случае отбросьте
ядро, постарайтесь прочистить кончик пипетки или замените ее новой.
13. Выдвиньте из капли обе пипетки; в энуклеационной пипетке все еще
находится мужской пронуклеус.
14. Подвиньте камеру так, чтобы в поле зрения оказалась капля суспензии
вируса Сендай. Введите энуклеационную пипетку в эту каплю.
35. Сообщите пипетке положительное давление, достаточное для того, чтобы
нуклеопласт частично вышел из кончика пипетки и омывался вирусной
суспензией, затем втяните его обратно на расстояние около 100 мкм так,
чтобы небольшой объем вирусного препарата занял кончик пипетки.
316
Глава 12
16. Выведите пипетку из этой капли. Поставьте в поле зрения каплю с
яйцами-реципиентами и захватите яйцо так же, как вы это делали при
энуклеации (место легко узнать по полярному тельцу и деформации блестящей
оболочки) (рис. 12.5,В).
17. Введите пипетку для переноса в первоначальное отверстие в блестящей
оболочке и осторожно выпустите вирусный препарат и нуклеопласт в
перивителлиновое пространство (рис. 12.5,?; Ж). Дополнительный цитопласт,
расположенный в пипетке проксимальнее кариопласта, во время этой операции
способствует выталкиванию кариопласта из кончика пипетки, и, кроме того,
играет роль буфера, регулирующего равномерность движения масла. Если
пронуклеус в кариопласте сопровождается большим количеством цитоплазмы,
размеры кариопласта можно уменьшить: как только пронуклеус окажется в
блестящей оболочке, выведите пипетку, отщипнув излишки цитоплазмы, как
уже было описано выше.
Слияние может произойти в любой момент примерно в течение следующего
часа, а иногда и через несколько минут после переноса (рис. 12.5,3).
18. Повторите процедуру переноса со всеми реципиентными яйцами.
19. Перенесите камеру на препаровальный микроскоп и соберите все яйца
вместе, быстро отмойте их и культивируйте в М16+БСА.
20. В конце эксперимента промойте все яйца в девяти каплях свежей
М16+БСА, внимательно проверьте, произошло ли слияние и продолжайте
культивировать в этой среде.
3.4. Другие варианты переноса ядер
Гетерозиготные диплоидные гиногенетические яйца могут быть получены
способом, описанным в разд. 3.3, или путем использования гаплоидных
партеногенетических яиц (рис. 12,6). Обнаружено, что развитие
гетерозиготных яиц с материнским геномом не отличается от развития
партеногенетических яиц, которые были диплоидизированы путем подавления
формирования второго полярного тельца. Подобным образом можно получить
разнообразные анеуплоидные яйца. Перенос в перивителлиновое пространство
в течение короткого времени одного за другим нескольких кариопластов,
может привести к их слиянию с плазматической мембраной яйца и к созданию
триплоид-ных или тетраплоидных яиц с разным числом материнских и
отцовских геномов.
Трансплантация ядер в яйца
317
В Г
Рис. 12.6. Получение гетерозиготного днплондного гиногенетнческого яйца
путем использования в качестве донора оплодотворенного яйца, а в качестве
реципиента - гаплоидного партеногенетического яйца. А-Г. Извлечение
женского пронуклеуса из оплодотворенного яйца. Д-Е. Перенос женского
пронуклеуса в гаплоидное партеногенетическое яйцо. Ж. Перед слиянием. 3.
После
слияния.
Техника манипуляций с ядрами от эмбрионов более поздних стадий развития в
основном та же, что и описанная в разд. 3.3 [13, 14]. Размер пипетки для
переноса должен быть немного изменен в соответствии с размером
трансплантируемого ядра. Ядра эмбрионов на 8-клеточной и более поздних
стадиях эмбрионального развития часто бывают плохо видны, особенно трудно
проследить за слиянием нуклеопласта с яйцом. Существует
318
Глава 12
возможность переноса ядер в 2-клеточные бластомеры. В этом случае, как бы
тщательно ни была проделана операция, кариопласт имеет тенденцию
проскользнуть в щель между бластомерами, поэтому имеет смысл оставить
оперированные эмбрионы в манипуляционной камере и наблюдать за ними, пока
не произойдет слияние. Таким образом, нам удалось получить 2-клеточные
химеры: удалив
ядро из одной клетки 2-клеточного эмбриона FiXFi(F2), мы заменили его
ядром 2-клеточного эмбриона CFLPXCFLP. Поскольку химерные эмбрионы все
еще находятся в блестящей оболочке, их можно перенести на 2- или 4-
клеточной стадии в яйцеводы приемной матери 1-го дня "беременности" (гл.
13, разд. 6.4.5). Из шести таких эмбрионов, перенесенных на 4-клеточной
Предыдущая << 1 .. 116 117 118 119 120 121 < 122 > 123 124 125 126 127 128 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed