Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
располагалась с небольшим наклоном- под углом <5°.
Трансплантация ядер в яйца
313
5. Введите кончик пипетки в поле зрения микроскопа и сфокусируйте
регулировкой высоты манипулятора. С помощью шприца Agla заполните пипетку
маслом до самого кончика, а затем отодвиньте собранный блок на край
микроскопа.
6. Точно так же присоедините пипетку для трансплантации ядер к шприцу де
Фонбрюна на правом манипуляторе и заполните маслом. Позаботьтесь о том,
чтобы скос кончика пипетки был виден в микроскопе абсолютно вертикально
(см. рис. 12.3,Ж). Отодвиньте собранный блок в сторону.
7. Наконец, поставьте в центр микроскопа манипуляционную камеру с
операционной каплей в поле зрения. Относительные углы и положения
инструментов должны соответствовать рис. 12.4, Б.
8. Осторожно введите в камеру инструменты, сначала один, затем другой,
пока они не окажутся в капле. Каждый инструмент после использования
должен быть во избежание столкновения отодвинут в капле в свое крайнее
положение вперед или назад.
3.3. Извлечение и перенос ядер
В качестве примера применения метода ниже будет детально описано
получение гетерозиготных диплоидных андрогене-тических яиц. В качестве
доноров и реципиентов использованы яйца на пронуклеарной стадии,
полученные от скрещивания гибридных самок с самцами линии CFLP.
1. Соберите яйца примерно через 18 ч после инъекции чХГ и после удаления
клеток кумулюса (гл. 2, разд. 2.1), культивируйте в течение 1 ч в М16+БСА
(гл. 2, разд. 5.2).
2. Отберите ранние пронуклеарные яйца и рассортируйте их в зависимости от
положения пронуклеуса: те из них, у которых пронуклеусы занимают четко
периферическое положение, используйте в качестве реципиентов, яйца более
поздних стадий со сближенными и более крупными пронуклеусами- в качестве
доноров. Примерно по 30 яиц поместите в большие капли среды PNC под
маслом и до операции культивируйте в негазованном инкубаторе по крайней
мере 15 мин.
3. Приготовьте яйца-реципиенты, удалив женский пронуклеус. Ориентируйте
яйцо таким образом, чтобы при удерживании его за область полярного тельца
оба пронуклеуса были в фокусе и чтобы у прижатой к яйцу скошенной пипетки
мужской пронуклеус остался позади, а женский лежал впереди. Это поможет
более четко различать про-
314
Глава 12
г
Вирус
Женский пронуклеус НукЛвуСЫ ПОСЛв ВХОЖде-
иия пипетки, когда мор-А фология яйца изменится.
Чтобы сделать правильный выбор между пронуклеусами, следует учитывать,
что жен-Б ский пронуклеус обычно имеет заметно меньшие размеры и на
ранних стадиях располагается вблизи от второго поляр-8 ного тельца (см.
гл. 2, рис. 2.1). Поскольку спермий может войти в яйцо в любой точ-Г|ке
поверхности, мужской пронуклеус иногда может занять аналогичное положение
по отношению к полярному тель-вуферный д ДУ- Абсолютные размеры про-
цитопласт нуклеусов на любой стадии Л-> cfZ могут варьировать у разных
масло яиц, но женский пронуклеус всегда меньше. С другой стороны, у яиц
более поздних стадий, где пронуклеусы мигрировали к центру и увеличились,
различия в размерах иногда перестают быть очевидными. Яйца, у которых
идентификация пронуклеусов вызывает сомнения, следует отбросить. (Число
ядрышек для идентификации значения не имеет.)
4. Маневрируйте яйцом с помощью удерживающей пипетки и пипетки для
энуклеации до тех: пор, пока не появится' возможность осторожно, но
прочно захватить его удерживающей пипеткой, при этом часть блестящей
оболочки и района полярного тельца засасывается в удерживающую пипетку
(рис. 12.5,А).
5. Приподнимите немного яйцо со дна капли, сфокусируйте микроскоп на
удаленном крае блестящей оболочки и поставьте в фокус энуклеационную
пипетку.
ж
Рис. 12.5. Получение гетерозиготных диплоидцых андрогенетических яиц. А-
Г. Удаление женского пронуклеуса из оплодотворенного яйца для получения
гаплоидного андрогеиети-ческого яйца. Д-Ж. Перенос второго мужского
пронуклеуса в гаплоидное андрогенетическое яйцо. 3. После слияния.
Трансплантация ядер в яйца
315
6. Осторожно прижмите энуклеационную пипетку к яйцу, вдавив его блестящую
оболочку, но не прорывая мембрану (рис. 12.5,5).
7. Придвиньте кончик пипетки к женскому пронуклеусу и осторожно сообщите
пипетке небольшое отрицательное давление. Мембрана яйца, деформируясь,
втянется в пипетку, за ней последует пронуклеус.
8. Как только пронуклеус окажется внутри кончика пипетки, осторожно
выдвиньте пипетку из блестящей оболочки (рис. 12.5,5). При этом мембрана
яйца останется в узкой трубке конца пипетки. Отщипните это выпячивание
мембраны, скользнув кончиком пипетки по краю отверстия в блестящей
оболочке. Разорванные края мембраны яйца обычно сливаются по обе стороны
разрыва (рис. 12.5, Г).
9. Повторите операции, указанные в пп.З-8, со всеми яй-цами-репициентами
и перенесите женские пронуклеусы в новую каплю.
10. Подвиньте камеру так, чтобы в поле зрения оказались донорские яйца.
Перемещайте яйцо, пока мужской пронуклеус не окажется в нужном положении,
