Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
20°С/мин. Другой способ: пробирку для кипячения (внутренний диаметр 35
мм, наружная высота 200 мм) охладите в ЖА, затем подвесьте ее на воздухе
при комнатной температуре и переместите в нее образец из ЖА; его нагрев
будет происходить со скоростью около 10°С/мин.
Независимо от скорости нагрева, после того как исчезнут остатки льда,
держите образец при комнатной температуре в течение 5 мин до того, как
приступите к удалению ДМСО.
3.6. Удаление ДМСО после оттаивания
Поскольку охлаждение образца ведется в присутствии проникающего
криопротектора, возникает необходимость удалить это соединение после
размораживания клеток, чтобы избежать их повреждения в результате
осмотического шока. Адаптация эмбрионов при возвращении в нормальные
физиологические условия (т. е. из среды с осмоляльностью в 1,5 осмоль в
культуральную среду с осмоляльностью около 0,3 осмоль) зависит от:
1) количества криопротектора, проникшего в бластомеры перед охлаждением;
2) их относительной проницаемости для воды и протекторного соединения;
3) температуры.
Вода обычно проникает легче, чем протектор, поэтому в результате
разбавления суспензии транспорт воды в клетку будет превалировать над
транспортом криопротектора из клетки и бластомеры разбухнут. Контроль
степени разбухания принято осуществлять путем поэтапного удаления
криопротектора из мышиных эмбрионов при 0°С или 20 °С [1, 2]. В последнее
время было показано, что эмбрионы мыши переносят быстрое
338
Глава 13
двухступенчатое удаление 1,5 М ДМСО при комнатной температуре [13].
Процедура удаления ДМСО из ооцитов и эмбрионов после оттаивания
заключается в следующем:
1. После того как в образце растает лед, сделайте царапину на шейке
ампулы и отломите верхушку.
2. Подождите 5 мин, чтобы образец приобрел комнатнук> температуру.
3. Добавьте 1 мл М2 (при комнатной температуре) к образцу объемом 0,3 мл
и тщательно перемешайте.
4. Спустя 1 мин, воспользовавшись пластиковой пипеткой на 1 мл (Falcon),
перенесите содержимое ампулы в эмбриологическое часовое стекло.
5. Сполосните ампулу дважды средой М2, для каждого ополаскивания берите
по 1 мл, и затем переносите в часовое стекло.
6. Соберите эмбрионы в хорошо оттянутую пастеровскую пипетку и отмойте,
дважды сменив М2 (по 2 мл на отмывку).
Ооциты после удаления ДМСО оплодотворяются in vitro (разд. 6.2), затем их
переносят в псевдобеременную приемную мать (разд. 6.4). Оплодотворенные
яйца и эмбрионы можно переносить мыши-реципиенту сразу же, но
предварительный период культивирования (разд. 6.3) повышает их
выживаемость.
3.7. Техника безопасности
Совершенно необходимо знать и строго соблюдать правила техники
безопасности при работе с жидкими газами!
1. ЖА, заполняющий наружный сосуд Дьюара охлаждающего устройства, кипит и
разбрызгивается. Защищайте глаза и кожу.
2. Алюминиевый контейнер для хранения образца после охлаждения до -196 °С
начинает прилипать к коже. Надевайте свободные перчатки.
3. Плохо запаянные ампулы после хранения содержат ЖА и в результате при
нагревании могут взрываться. Не рискуйте. Всегда надевайте маску или по
крайней мере защитные очки, если достаете ампулы из ЖА и начинаете их
размораживать. Позаботьтесь о безопасности окружающих.
4. Витрификация
Цель исследований по витрификации состоит в упрощении процедур криозащиты
эмбрионов. Известно, что высококонцентрированные растворы криопротекторов
способны охлаждаться
Низкотемпературная консервация янц н эмбрионов мыши
до низких температур без кристаллизации [23]. В результате
сверхохлаждения вязкость этих растворов настолько увеличивается, что они
становятся стекловидно-твердыми; этот физический процесс называется
витрификацией. При использовании витрификации эмбрионы уравновешиваются в
смеси криопротекторов (витрификационном растворе) и, после того как
цитоплазма обезводится, суспензию эмбрионов (в пластиковой пайете)
витрифицируют путем помещения в ЖА. Скорость-охлаждения практически не
имеет значения, если она достаточно высока для того, чтобы предотвратить
кристаллизацию. Нагревание также должно быть достаточно быстрым, чтобы не
произошла девитрификация (кристаллизация) в интервале температур от -100
до -25 °С. Таким образом, витрификация обеспечивает быстрый и простой
способ криозащиты эмбрионов. При этом отпадает необходимость сидинга
эмбриональной суспензии и контролируемого периода медленного охлаждения..
По-видимому, основными факторами, обусловливающими успех витрификации,
служат:
1) состав витрификационного раствора;
2) процедуры, применяемые для осмотического уравновешивания
(эквилибрации) эмбрионов в растворе.
4.1. Витрификационный раствор
Витрификационный раствор должен быть достаточно концентрированным, чтобы
в нем не наступила кристаллизация при охлаждении с применяемыми на
практике скоростями, и в то же время он не должен обладать химической
токсичностью или вызывать осмотическое повреждение эмбриона при
эквилибрации или разбавлении. Витрификационный раствор (ВР1: табл. 13.4),
