Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
который предложили Роли и Фейхи [23], представляет смесь следующих
криопротекторов в модифицированном солевом растворе Дульбекко:
1) эквимолярные концентрации ДМСО и ацетамида, применение которого
основано на способности некоторых амидов снижать химическую токсичность
растворов концентрированного ДМСО [24, 25];
2) пропиленгликоль благодаря его стеклообразующим свойствам;
3) непроникающий полимер (полиэтиленгликоль), повышающий способность
раствора витрифицироваться [26].
Воздействие исходным раствором ВР1 отрицательно сказывается на развитии
8-клеточных эмбрионов мыши как in vitro, так и in vivo [6], поэтому для
витрификации эмбрионы суспендируют в 90%-ном растворе ВР1 (табл. 13.5),
концентрация криопротекторов в котором менее токсична.
340
Глава 13
Таблица 13.4. Состав исходного витрификациоиного раствора ВР1 и HEPES-
забуференного солевого раствора (НВ1)
Состав BP11) | НВ1
гУл мМ П/л мМ
Буферный раствор NaCl 8,000 136,90 8,000 136,90
:КС1 0,200 2,68 0,200 2,68
:МцС12-6Н20 0,050 0,25 0,100 0,50
КН2Р04 0,120 0,88 0,136 1,00
СаС12-2Н20 0,010 0,07 0,120 0,90
•Пируват Na - - 0,036 0,33
HEPES2' 4,766 20,00 4,766 20,00
Глюкоза 1 ,000 5,56 1,000 5,56
БСА3' 0,750 - 3,000 -
'Пенициллин G (соль - - 0,060 -
калия) Феноловый красный 0,010 - 0,010 -
Криопротекторы ДМСО 20,502 2,62
Ацетамид 154,970 2,62 - -
Пропилеигликоль 100,00 1,30 .- -
'Полиэтиленгликоль 60,00 6,0% в/о - -
(м. в. 8000)
pH витрификациоиного раствора - 7,8-8,0. pH НВ1 - 7,2.
1) Хранить в стеклянной посуде.
2) Calbiochem-Boehring: Ultrol.
3) Кристаллический: Miles-Serovac.
4.2. Осмотическое уравновешивание (эквилибрация) эмбрионов в
витрификационном растворе
Процедура эквилибрации разработана с целью получения концентрированной
обезвоженной цитоплазмы, способной к витрификации при последующем
охлаждении. Эта процедура не должна вести к химической токсичности или
значительному осмотическому стрессу ни при эквилибрации, ни при
последующем разбавлении [23]. Возможность повреждения эмбрионов отчасти
зависит от степени проникновения криопротекторов, содержащихся в
витрификационном растворе, в цитоплазму. Частичное проникновение, по-
видимому, способствует успешной консервации, однако полное - повышает
вероятность повреждения клетки вследствие химической токсичности и
осмотического разбухания при разбавлении. На практике эмбрионы
уравновешивают при комнатной температуре в 25%-ном ВР1 н затем в два
приема подвергают воздействию повышающихся концентраций витрификациоиного
раствора при 4°С.
Соответствующая процедура описана в табл. 13.5.
Низкотемпературная консервация яиц и эмбрионов мыши
341
Таблица 13.5. Выдерживание 8-клеточных эмбрионов мыши в внтрнфнкацнонном
растворе
A. Растворы
1. Приготовьте три разведения исходного ВР1, используя для этого НВ1
(табл. 13.4):
1) 25%-ный ВР1: (1 часть ВР1 :3 части НВ1)
2) 50%-ный ВР1: (1 часть ВР1 : 1 часть НВ1)
3) 90%-ный ВР1: (9 частей ВР1 : 1 часть НВ1)
2. Охладите 50%-иый ВР1 и 90%-ный ВР1 до 4 °С.
Б. Подготовка пайеты
1. Отсосите 1-см столбик 90%-ного ВР1 в пластиковую пайету (трубочку) на
0,25 см3; пробка из ваты/PVA должна увлажниться.
2. С помощью инъекционной иглы (№ 20, длина 3,5 см) и стеклянного шприца
введите 2-см столбик (~40 мкл) 90%-ного ВР1 в центр пайеты.
3. Охладите пайету до 4 °С.
B. Процедура ступенчатой эквилибрации
1. Перенесите эмбрионы с помощью микропнпеткн в 3 мл 25%-ного ВР1 и
тщательно перемешайте, осторожно вращая чашку.
2. Подождите 15 мин.
3. Перенесите эмбриональную суспензию в холодную комнату (2-4°С).
Подождите 10 мин, а затем в холодной комнате проведите и остальные этапы
процедуры.
4. Перенесите эмбрионы в небольшом объеме 25%-ного ВР1 в 3 мл холодного
50%-пого ВР1. Тщательно перемешайте суспензию микропипеткой. (Если
эмбрионы всплыли, смочите пнпетку 50%-ным ВР1 н погрузите ею эмбрионы на
дно чашки.)
5. Через 10 мин перенесите эмбрионы в 90%-ный ВР1, загрузите сжавшиеся
эмбрионы в 2-см столбик 90%-ного ВР1 в пайете.
6. Герметизируйте пайету путем термической сварки обеих ее концов
(воспользуйтесь прибором для склейки пластиковых пакетов).
Примечание: не нагрейте эмбриональную суспензию пальцами.
4.3. Охлаждение
Через 10 мин после переноса эмбрионов в 90%-ный ВР1 витрифицируйте
эмбриональную суспензию охлаждением пайеты в ЖА. Единственное требование
касается скорости охлаждения: она должна быть достаточно высокой для
предотвращения кристаллизации (>20°С/мин). Существуют три способа
охлаждения:
1) прямой перенос в ЖА;
2) перенос в холодные пары N2 (-150 °С), т. е. в горловину замораживателя
(~200°С/мии);
3) перенос в постепенно охлаждающую изопентановую баню (~20°С/мин) при
температуре около -120°С, а затем прямо в ЖА.
342
Глава 13
Иногда быстрый перенос в ЖА может приводить к раскалыванию остекленевшей
суспензии, в результате оболочки и бластомеры некоторых эмбрионов
повреждаются.
4.4. Хранение витрифицированных образцов
Витрифицированные эмбриональные суспензии следует хранить при температуре
