Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 129

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 123 124 125 126 127 128 < 129 > 130 131 132 133 134 135 .. 162 >> Следующая

7. Повторите пп. 3 и 4.
8. Охладите образец до 0 °С.
9. Подождите 15 мин, прежде чем перенести образец в баию для сидинга.
б) прикрепить образцы к держателям с помощью резиновых полосок (рис.
13.1), подготовив их к переносу в баню для сидинга;
в) отрегулировать температуру бани для охлаждения и бани для сидинга.
3.3. Индукция образования льда в суспензионной среде: "сидинг"
В процессе охлаждения со скоростью, не снижающей жизнеспособности
эмбриона, спонтанное замерзание суспензионной среды при достижении точки
замерзания (около -3,5 °С) происходит редко, и образец может
переохладиться до -21 °С. При образовании льда, которое сопровождается
выделением латентного тепла, температура образца поднимается до точки
плавления, затем резко падает, пока не установится температурное
равновесие с охлаждающей баней. Точная скорость охлаж-
Низкотемпературная консервация яиц и эмбрионов мышн
33&
Рис. 13.1. Держатель ампул, изготовленный из медной проволоки (1),
покрытой пластиком и спаянной с медным винтом (2), ввинчивающимся в
брусок из перспекса (3). На бруске из перспекса крепится до четырех ампул
с помощью
резиновой полоски.
дения зависит от разницы температур образца и охлаждающей, бани и может
быть порядка 10 °С/мин. Обезвоживание, необходимое для выживания клетки,
происходит только после образования льда в суспензионной среде. Если
скорость охлаждения после образования льда слишком высока, количество
воды,. покидающее клетку в процессе внутриклеточного замораживания,
приведет ее к гибели.
Для того чтобы не допустить переохлаждения, в образце индуцируют
образование льда (сидинг) при температурах, следующих сразу ниже точки
замерзания суспензионной среды.
1. После обработки образца ДМСО перенесите запаянную' ампулу из ледяной
бани при 0°С в баню с постоянной температурой-5-6°С (баня для сидинга;
разд. 3.3.1).
2. Подождите 2 мин.
3. Индуцируйте сидинг в образце, прикоснувшись к ампуле сразу над
мениском концами тонкого пинцета (Watchmaker, № 5 подходит для этого
идеально), предварительно охлажденного в жидком азоте. Как только на
стекле появится изморозь, уберите пинцет. Замечание: будьте осторожны, не
переохладите образец.
4. Возвратите ампулу в баню для сидинга.
5. Через 5 мин, убедившись в том, что в образце сформировался лед,
перенесите ампулу в охлаждающую баню при той же температуре, какая была в
бане для сидинга.
Другие способы сидинга описаны в работах [9, 10].
3.3.1. Байя для сидиига
Для сидинга можно использовать любую баню, в которой может поддерживаться
температура -5 или -6°С дольше-15 мин. Мы обычно пользуемся постоянно
перемешиваемым
334
Глава 13
промышленным метиловым спиртом или этанолом, охлаждаемым в
термоэлектрической бане (Virtis minifreezer: Technation, Middlesex,
Англия). Но может подойти и обычная смесь поваренной соли со льдом.
Другое оборудование описано Лейбо и Мейзуром [9].
3.4. Охлаждение
Жизнеспособность эмбрионов зависит от эффективности выведения
внутриклеточной воды до того, как будет достигнута температура
замерзания. Если обезвоживание происходит в процессе охлаждения, скорость
охлаждения приобретает критическое значение. Если охлаждение идет слишком
быстро, эмбрион не успевает адаптироваться до того момента, когда
температура достигнет точки, при которой может произойти ¦инициация
кристаллизации, в результате содержимое клетки замерзает с образованием
летальных количеств внутриклеточного льда. И напротив, если охлаждение
идет слишком медленно, клетки подвергаются действию высоких концентраций
внеклеточных растворов слишком долго, в результате изменяется pH и объем
клеток уменьшается. В идеальном случае клетки должны охлаждаться со
скоростью, достаточно медленной для того, чтобы они продолжали оставаться
в осмотическом равновесии с внеклеточным раствором.
3.4.1. Скорость охлаждения
Для оптимальной выживаемости эмбрионы млекопитающих требуют относительно
низких, по сравнению с другими клетками, скоростей охлаждения (0,2-
2,0°С/мин). На практике эмбрионы мыши в 1,5 М ДМСО охлаждают со скоростью
0,3- 0,5сС/мнн. Скорость охлаждения измеряется в пределах от -10 до -60
°С. Медленное охлаждение заканчивают при-40 °С или при температурах -70
°С погружением образца в ЖА. Выживаемость 8-клеточных эмбрионов в 1,5 М
ДМСО снижается, если медленное охлаждение заканчивают при температурах
выше -35°С или в пределах от -45 до -70 °С. Бластоцисты мыши толерантны к
прекращению медленного охлаждения в широком интервале температур [13], но
обычно их медленно охлаждают до -40 или -70 °С. Ооциты до погружения в
жидкий азот медленно охлаждают до температуры ниже -70 °С.
3.4.2. Охлаждающая баня
Охлаждающую баню наподобие той, которой мы пользуемся в своей лаборатории
(рис. 13.2), детально описали Лейбо и Мейзур [9]. Она состоит из частично
разреженного (10-
Низкотемпературная консервация янц н эмбрионов мышн
335
Регистратор
температуры
100 мм ртутного столба) не-•серебреного сосуда Дьюара (емкость 950 мл;
Предыдущая << 1 .. 123 124 125 126 127 128 < 129 > 130 131 132 133 134 135 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed