Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
внутренний Регистратор диаметр 70 мм; внутренняя темпеРат',рр' высота 300
мм; т. е. Dilvac, "*"(c) поставщик Day-Impex Ltd,
Colchester, Англия), содержащего 500 мл охладителя (промышленный
метиловый спирт (c) или этанол). Охладитель должен постоянно перемешиваться
(для этого используют мешалку с регулируемой скоростью). Этот сосуд
Дьюара помещают в наружный (емкость ~4 л), содержащий
ЖА. Быстрота охлаждения зависит от объема охладителя, степени
разреженности внутреннего сосуда и глубины его погружения в ЖА. В
идеальном случае для наблюдения за температурой используют медь-
константановые термопары и регистратор низких температур (Speedomax 2500
multipoint; поставщик Zeeds and Northrup LTD, Birmingham,
UK). Одна термопара регистрирует температуру охладителя, другая помещена
в "пустой" образец (учтите, что
необходимо инициировать сидинг и в "пустом", контрольном образце).
Разница между температурами охладителя и образца обычно составляет около
1 °С. Если подходящего регистратора нет, температурные характеристики
сосуда Дьюара можно получить заблаговременно, воспользовавшись
низкотемпературным термометром и секундомером. Поддержание постоянного
объема охладителя и погружение внутреннего сосуда на определенную глубину
в ЖА обеспечивают высокую воспроизводимость скорости охлаждения. Если
глубина погружения в ЖА остается постоянной все время, кривая охлаждения
будет слегка криволинейной. Для поддержания постоянной скорости
охлаждения между -10 и -60 °С можно постепенно углублять внутренний сосуд
в ЖА. Сравнение выживаемости эмбрионов после охлаждения с постоянной
скоростью с соответствующим показателем для охлаждения с постепенно
уменьшающейся ско-
Рис. 13.2. Поперечное сечение охлаждающей ванны. 1. Непосеребренный сосуд
Дьюара с частичным вакуумом. 2. Охладитель. 3. Мешалка с меняющейся
скоростью. 4. Сосуд Дьюара посеребренный, с высоким вакуумом. 5. Жидкий
азот. 6. Ампула с эмбрионами. 7. Держатель образцов с удобным доступом к
нему (см. рис. 13.1). 8, 9. Медь-константановые термопары, регистрирующие
температуру образца и охладителя.
336
Глава 13
ростью не проводилось. Мы пользуемся постоянной скоростью, но, по мнению
Лейбо и Мейзур [9], более эффективно постепенное уменьшение скорости, так
как при этом остается время для выравнивания осмотических соотношений при
более низких температурах.
3.4.3. Охлаждение образца после инициации кристаллизации
После сидинга образец следует подвергнуть следующим процедурам.
1. Проконтролируйте, чтобы температура охладителя отличалась от
температуры бани для сидинга в пределах 0,5 °С.
2. После уравновешивания температур (~5 мин, наблюдайте за температурой
пустого образца) опустите ампулу в охлаждающую баню так, чтобы содержимое
было ниже уровня охладителя.
3. Отрегулируйте наружный сосуд Дьюара, содержащий ЖА, чтобы он давал
скорость охлаждения порядка 0,3- 0,5 °С/мин.
4. Прекратите медленное охлаждение, когда температура образца достигнет -
40 °С, или продолжайте охлаждать ниже -70 °С. По достижении выбранной
температуры извлеките ампулу из охлаждающей бани и погрузите ее (по-
прежнему прикрепленную к держателю) в ЖА.
5. К следующему пункту приступайте через 15 мин.
6. Охладите алюминиевый контейнер для хранения ампул в ЖА.
7. Не извлекая ампул из ЖА, разрежьте резиновую полоску, прикрепляющую
ампулы к держателю.
8. С помощью длинного пинцета, концы которого предварительно охлаждены в
ЖА, загрузите ампулы в контейнер для хранения.
9. Перенесите контейнеры, погруженные в ЖА, в хранилище.
3.5. Размораживание
Температура, при которой заканчивается медленное охлаждение, определяет
скорость нагрева, необходимую для оптимального выживания эмбрионов. Если
медленное охлаждение заканчивается при относительно высоких субнулевых
температурах (около -40 °С), эмбрионы содержат некоторое количество
внутриклеточной воды, которая витрифицируется при быстром охлаждении до -
196 °С [22]. Чтобы избежать девитрифи-кации и роста летальных количеств
внутриклеточного льда,
Низкотемпературная консервация яиц и эмбрионов мыши____________337
необходим быстрый нагрев. И наоборот, эмбрионы, медленно охлаждаемые до
температур ниже -70 °С, нуждаются в медленном, а не быстром нагреве.
Возможно, медленное насыщение водой необходимо для постепенной
реорганизации субклеточных структур. Для большинства клеток млекопитающих
оптимальная выживаемость достигается в результате быстрого нагрева и не
зависит от режима охлаждения.
При размораживании эмбрионов мыши, медленно охлаждавшихся (0,3-0,5°С/мин
в 1,5 М ДМСО) перед быстрым охлаждением до -196 °С, нужно выполнить
следующие процедуры:
1. Если медленное охлаждение заканчивалось при -40 °С, быстро нагревайте
образец со скоростью 50°С/мин, опустив его в воду при 40 °С; помешивайте
воду ампулой.
2. Если медленное охлаждение продолжалось ниже -70 °С, медленно
нагревайте образец со скоростью от 4 до 20 °С/мин. Извлеките образец из
ЖА и установите его на решетке, обеспечивающей скорость нагрева около
