Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
соответствует 0,135 мг ксилозы (1 : 7,4 = = 0,135 мг). Ксиланазную
активность 1 мл культуральной жидкости выражают в миллиграммах ксилозы на
1 мл реакционной смеси.
Реактивы: 1) 0,2 М раствор ацетатного буфера (pH 5,4); 2) ксилан; при
отсутствии готового препарата его можно получить из кукурузных кочерыжек
или пшеничной соломы экстракцией 6%-ным раствором NaOH и осаждением
этиловым спиртом [140]; 3) медно-фосфатный реактив: 28 г безводного
К2НР04 и 40 г сегнетовой соли растворяют в 700 мл воды, добавляют 100 мл
1 н. раствора NaOH и затем вносят 80 мл 10%-ного раствора Си S04 • 5Н20.
После растворения добавляют 180 г безводного Na2S04, и весь объем
раствора доводят до 1 л. Раствор отстаивают 1-2 ч, затем декантируют или
фильтруют; 4) 0,005 н. KJ;
190
5) 2 н. H2S04; 6) 0,005 н. раствор Na2S204 . 5Н20 готовят разбавлением
0,1 н. основного раствора перед титрованием. При разбавлении на 1 л
раствора добавляют 2 мл 10%-ного раствора NaOH; 7) раствор ксилозы в
концентрации 1 мг в 1 мл.
V.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
V.6.I. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Пектолитические ферменты катализируют превращения пектиновых веществ
(рис. 89) - склеивающего субстрата растительных клеток [48]. В состав
комплекса пектолитических ферментов входят пек-тинэстераза,
полигалактуроназы. Пектинэстераза (К.Ф.3.1.1.11) катализирует гидролиз
сложноэфирных связей в молекуле пектина с
кислот кислота
Рис. 89. Ферментативный гидролиз молекулы растворимого пектина.
образованием метилового спирта и свободных карбоксильных групп.
Полигалактуроназы катализируют гидролиз полигалактуроновой кислоты по
гликозидным связям с образованием остатков галактуроновой кислоты. По
характеру и относительной скорости гидролиза пектина и пектиновой кислоты
различают эндо- (К.Ф.3.2.1.15) и экзо-(К.Ф. 3.2.1.40) полигалактуроназы.
Известно несколько качественных и количественных методов определения
пектиназ.
V.6.2. КАЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕКТИНАЗ
Наиболее простые методы: определение мацерирующей способности по степени
мацерации растительной ткани под действием культуральной жидкости после
роста гриба или вытяжки из его мицелия [649] и по степени роста грибов на
минеральной среде с 0,5% пектина в качестве источника углерода (последний
метод обычно используют для выявления пектиназ при первичном отборе) [1],
191
V.6.2.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НАЛИЧИЯ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
МАЦЕРАЦИЕЙ РАСТИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ
Тонкие срезы корней моркови, картофельных клубней и других корнеплодов
помещают в пробирку или на предметное стекло в стерильный фильтрат
культуральной жидкости исследуемого гриба, который культивировался на
среде с пектинсодержащим субстратом. Срез выдерживают при 30° С. Через
различные промежутки времени наблюдают под микроскопом процесс мацерации
ткани, т. .е. распад ее на отдельные клетки. Мацерация ткани
свидетельствует о наличии пектиназ, а время ее наступления - показатель
их относительной активности.
V.6.2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ
ФЕРМЕНТОВ ПО СТЕПЕНИ РОСТА ГРИБОВ
Грибы выращивают на минеральной среде с 0,5% пектина и определяют
интенсивность роста мицелия визуально и по сухой массе мицелия в разные
сроки культивирования. Одновременно визуально определяют время
исчезновения нерастворимого пектина. В культуральной жидкости штаммов
разного возраста определяют наличие продуктов гидролиза пектина, по
которым судят о степени его гидролиза. Для характеристики содержания и
состава продуктов гидролиза пектина - галактуроновой кислоты и
олигогалактуронидов - применяют метод восходящей или круговой бумажной
хроматографии [75]. На хроматографическую бумагу микропипеткой наносят на
линию старта по 0,01 мл ферментных гидролизатов. Хроматографическую
бумагу помещают в герметический сосуд с растворителем, в состав которого
входит смесь уксусной кислоты, я-бутилового спирта и воды в соотношении
1:4:5. Через 20 ч бумагу вынимают, подсушивают и проявляют анилин-
фталатом: опрыскивают раствором насыщенного водой н-бутилового спирта
(100 мл), содержащего 1,6 г фталевой кислоты и 0,7 мл свежеперегнанного
анилина [250]. После опрыскивания хроматограмму выдерживают несколько
минут в сушильном шкафу при 105° С. Галактуроновая кислота проявляется
темно-розовым пятном, полигалактурониды - пятнами иного оттенка. В
качестве метчиков используют 0,5%-ные растворы D-галактуроновой кислоты и
сахаров: галактозы, арабинозы, глюкозы, ксилозы. За процессом гидролиза
наблюдают в течение 6-8 сут. Содержание продуктов гидролиза пектина
определяют в спиртовых элюатах проявленных пятен олигогалактуронидов и
галактуроновой кислоты на ФЭК-М при длине волны 430-460 нм [85].
Содержание в культуральной жидкости продуктов гидролиза пектина является
показателем не только активности, но и характера гидролиза пектина.
Преобладание галактуроновой кислоты свидетельствует о концевом механизме
гидролиза, а преимущественное содержание олигогалактуронидов - о наличии
