Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
на определение редуцирующих сахаров влияет присутствие Р-глюко-зидазы.
Поэтому для определения истинной активности экзо-Р-глю-каназы следует
вычесть активность редуцирующих сахаров, образованных при гидролизе
микрокристаллической целлюлозы или хлопкового волокна (при отсутствии
других целлюлозолитических ферментов), из общей активности.
181
Эндоглюканазы гидролизуют Р-1,4-глюканы неупорядоченно; их относят к |3-
1,4-глюканглюканогидролазам (К.Ф.3.2.1.4.). Эндоглюканазы можно
дифференцировать по неупорядоченному воздействию на
карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ) и скорости солюбилизации целлюлозы,
набухающей в фосфорной кислоте [579]. Лучшим субстратом для определения
эндо-Р-глюканазной активности (С*-ферментов) является растворимое
производное целлюлозы типа КМЦ, так как на нее не воздействуют другие
целлюлозолитические ферменты, кроме эндо-Р-глюканазы [579].
В настоящее время только экзо-р-1,4-глюканаза получена в очищенном виде и
дана ее физико-химическая характеристика. Все известные организмы,
гидролизующие нативную целлюлозу, способны образовывать по крайней мере
одну экзо-Р-глюканазу. В случае Tricho-derma viride, Т. koningii этот
фермент является Р-1,4-глюканцелло-биогидролазой [579, 585].
Р-Глюкозидаза, или целлобиаза (К.Ф.3.2.1.21), гидролизует главным образом
целлобиозу и высшие целлодекстрины до глюкозы. Этот фермент ускоряет
гидролиз целлюлозы, удаляя целлобиозу, которая является ингибитором экзо-
Р-глюканазы.
При изучении целлюлозолитических свойств грибов их выращивают на
минеральной среде Чапека с фильтровальной бумагой в качестве
единственного источника углерода. Полоски фильтровальной бумаги размером
6 X 1 см помещают в бактериологические пробирки, содержащие 5 мл
минеральной среды, стерилизуют при давлении 0,5 атм в течение 30 мин и
засевают изучаемыми культурами грибов 2-3-недельного возраста. Учет роста
грибов и определение целлюлозолитических свойств культуральных фильтров
проводят через 10-30 сут [50, 57, 408].
Y.4.2, КАЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗ
Наиболее простыми методами определения целлюлозолитической активности
являются качественные методы, которые включают визуальную оценку
изменения субстрата при росте грибов на целлюлозе, состав и
характеристику продуктов гидролиза целлюлозы.
У.4.2.1. ВИЗУАЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РОСТА ГРИБОВ
НА ФИЛЬТРОВАЛЬНОЙ БУМАГЕ
Рост грибов на целлюлозном субстрате оценивают по пятибалльной системе:
1-2 балла (+, ++) означают слабый рост мицелия гриба, спорообразование,
отсутствие разрушенных участков целлюлозы; 3-4 балла (+++, ++++) -
наличие обильного и хорошо развитого мицелия, обволакивающего целлюлозный
субстрат. В этом случае визуально отмечается деградация субстрата.
V.4.2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА САХАРОВ В КУЛЬТУРАЛЬНОЙ
ЖИДКОСТИ ГРИБОВ МЕТОДОМ КРУГОВОЙ БУМАЖНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
. О целлюлозолитической активности изучаемых штаммов грибов судят по
наличию и интенсивности пятен редуцирующих сахаров на хроматограмме [75],
182
Реактивы и оборудование: бутиловый спирт; ледяная уксусная кислота (чда);
дистиллированная вода; хроматографическая бумага (ленинградская
медленная); эксикатор, лодочка (4 X 35 см); микропипетки.
Последовательность определения. На лист хроматографической бумаги
накладывают крышку эксикатора и обводят ее графитным карандашом. Вырезают
круг диаметром 29 см. Циркулем вычерчивают окружности - стартовую
диаметром 8 и наружную - 27 см; делят окружность на 8 или 16 секторов. На
стартовой окружности в центре каждого сектора точками отмечают места
нанесения исследуемых растворов культуральных фильтров (стартовые точки).
За наружным кругом проставляют порядковые номера секторов и номера проб.
В центре круга прокалывают или аккуратно вырезают круглое отверстие для
фитиля. Плотный фитиль изготовляют из фильтровальной (или
хроматографической) бумаги длиной 15 см и шириной 1-1,5 см. Фитиль должен
плотно входить в отверстие круга. В каждом секторе на стартовую точку
микропипеткой наносят исследуемые растворы. Диаметр пятна не должен
превышать 3 мм. Поскольку при^выращива-нии грибов на фильтровальной
бумаге выход сахаров незначителен, для их обнаружения необходимо наносить
значительное количество культурального фильтрата (до 0,1 мл). Стандартные
растворы, 0,5%-ные растворы глюкозы и целлобиозы, наносят в количестве
0,001 мл. Затем на дно эксикатора ставят колбу или другой сосуд, в
который наливают 50-100 мл растворителя. Хроматограмму соединяют с
фитилем, нижний конец которого погружают в растворитель. Края
хроматограммы кладут на бортик эксикатора, эксикатор закрывают крышкой.
Разделение сахаров в камере, насыщенной парами растворителя, длится 24 ч.
В качестве растворителя используют смесь: бутиловый спирт, ледяная
уксусная кислота и вода (65 : 5 : 30). В делительную воронку вносят
указанную смесь, тщательно взбалтывают 5-10 мин и устанавливают
вертикально на 3-4 ч. За это время жидкость разделяется на два слоя. Для
работы используют верхний отстоявшийся слой.
