Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Билай В.И. -> "Методы экспериментальной микологии " -> 92

Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.

Билай В.И. Методы экспериментальной микологии — К.: Наукова думка, 1982. — 552 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiexpirementalnoymikologii1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 86 87 88 89 90 91 < 92 > 93 94 95 96 97 98 .. 279 >> Следующая

коэффициент (К) определяют по формуле К = xlxlt где х - показание прибора
(должно равняться 780); хг - отклонение от показания прибора.
Для анализа берут несколько пробирок (диаметром 2 см и высотой 18 см) по
количеству анализируемых проб, наливают в каждую по 20 мл субстрата и
ставят в ультратермостат или водяную баню с температурой 30 ± 0,2° С.
Пробирки выдерживают в ультратермостате в течение 10 мин для того, чтобы
их содержимое приняло указанную температуру. Затем, не вынимая пробирок
из ультратермостата, наливают в каждую по 10 мл анализируемого
ферментного раствора (или культуральную жидкость); содержимое пробирок
тщательно перемешивают и оставляют в ультратермостате при 30° С на 1 ч.
По истечении этого времени пробирки с реакционной смесью вынимают из
ультратермостата, добавляют в каждую по 2 мл 15%-ного раствора
сернокислого цинка для инактивации фермента и осаждения
высокомолекулярных продуктов пектолиза. Содержимое пробирок тщательно
перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр. Одновременно готовят
контрольные растворы. Для этого в пробирки наливают по 2 мл 15%-ного
раствора сернокислого цинка, 10 мл анализируемой культуральной жидкости и
20 мл субстрата. Содержимое пробирок энергично встряхивают в течение 2-3
мин до образования легко перемешивающегося раствора, после чего
фильтруют. Далее на интерферометре по инструкции, приложенной к прибору,
определяют величину смещения интерференционных полос, возникающего
вследствие различия показателей преломления контрольного и исследуемого
растворов. Для этого исследуемый раствор наливают в левое отделение
кюветы интерферометра с длиной грани 4 см, а контрольный раствор - в
правое отделение кюветы. Отсчет ведут по шкале барабана прибора. Для
обеспечения точности анализа разведения ферментов
194
необходимо подбирать таким образом, чтобы показания прибора не выходили
за пределы 400- 1250.
На основании полученных данных определяют пектолитическую активность в
условных единицах по уравнению ПКА = (0,06425 М + + 19,62)/т 1000 уел.
ед./мл, где М - показание прибора для данного разведения; т - количество
культуральной жидкости (мл), взятой на определение, или количество
ферментного препарата, содержащегося в 10 мл ферментного раствора,
взятого на определение (г); 0,06425; 19,62; 1000 - постоянные
коэффициенты, полученные при математической обработке экспериментальных
данных по изучению зависимости между количеством образующихся продуктов
гидролиза пектина в условиях метода и количеством единиц активности
фермента, взятого на анализ. В случае отклонения от показаний прибора (*)
в формулу для определения ПКА вводят поправочный коэффициент К (М • К).
Метод учета количества прогидролизованных а-1,4-гликозидных связей по
увеличению конечных восстанавливающих альдегидных групп в большей степени
характеризует активность экзополигалактуроназы. За единицу
экзополигалактуроназной активности принимают количество фермента, которое
в условиях определения при 30° С катализирует гидролиз 1 мкэкв
гликозидных связей в молекуле пектовой кислоты за 1 мин; активность
выражают числом указанных единиц в 1 г препарата (или 1 мл раствора).
V.6.3.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭКЗОПОЛИГАЛАКТУРОНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ
Активность экзополигалактуроназ определяют по увеличению количества
восстанавливающих альдегидных групп (ПГА/А). Готовят 1%-ный раствор
пектовой кислоты, для чего навеску пектовой кислоты, взятую с таким
расчетом, чтобы в 100 мл раствора содержался 1 г этой кислоты, медленно
всыпают при тщательном перемешивании в стакан с дистиллированной водой,
добавляют при перемешивании из бюретки по каплям 1 н. раствор едкого
натра, доводя pH раствора кислоты до 4,0. Полученный раствор пектовой
кислоты количественно переносят в мерную колбу соответствующей емкости,
объем доводят до метки дистиллированной водой, содержимое колбы
перемешивают и фильтруют через два слоя марли на воронке Бюхнера. Раствор
используют вдень приготовления. Затем в колбах емкостью на 100 мл готовят
реакционную смесь, состоящую из 10 мл 1%-ного раствора пектовой кислоты и
5 мл культурального фильтрата (разведение подбирают в зависимости от
активности исследуемого ферментного раствора). Общий объем реакционной
смеси - 15 мл.
Если для определения берут менее 5 мл раствора фермента, то недостающий
объем дополняют дистиллированной водой, которую вводят непосредственно
перед добавлением фермента. Пробы инкубируют в термостате при температуре
30 ± 0,2° С в течение 10, 20, 30 или 60 мин в зависимости от
ферментативной активности, добавляют 1,8 мл 1М раствора углекислого
натрия (106 г углекислого натрия в 1 л дистиллированной воды) (ГОСТ 83-
63) и 10 мл 0,1 н. раствора йода (25 г йодистого калия по ГОСТ 4232-65
растворяют в колбе емкостью 1 л в небольшом количестве дистиллированной
воды, помещая туда же 12,7 г йода по ГОСТ 4159-64. После растворения йода
объем раствора доводят до метки дистиллированной водой). Содержимое колб
Предыдущая << 1 .. 86 87 88 89 90 91 < 92 > 93 94 95 96 97 98 .. 279 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed