Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
эндополигалак-туроназ.
V.6.3. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
Пектинэстеразную активность (ПЭА) определяют по приросту свободных
карбоксильных групп или по количеству образовавшегося метилового спирта.
Наиболее распространен титрометрический метод
192
определения ПЭА по увеличению кислотности [266], при этом в реакционной
смеси поддерживают постоянное значение pH. За единицу ПЭА принимают
количество фермента, которое катализирует при 30° С и оптимальном рн
гидролиз 1 мкэкв сложноэфирных связей в молекуле пектина за 1 мин.
Субстрат-1%-ный раствор свекловичного пектина со степенью
метоксилирования не менее 80%. ПЭА выражают числом указанных единиц в 1 г
(или 1 мл) исследуемой пробы.
Значение ПЭА зависит от степени этерификации пектина. При работе с
различными субстратами сравнимые результаты получаются только при
пересчете полученных данных на субстрат со 100%-ной степенью
метоксилирования. В упомянутых условиях определения количество
расщепленных сложноэфирных связей пропорционально количеству фермента в
пределах 20% гидролиза.
У.6.3.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕКТИНЭСТЕРАЗЫ
Последовательность определения. Готовят реакционную смесь, состоящую из
20 мл 1%-ного раствора пектина, pH 4,0 (способ приготовления - см. раздел
V.6.3.2) и 10 мл культурального фильтрата (раз-ведение подбирают
экспериментально, и если для определения берут меньше 10 мл
культурального фильтрата, то недостающий объем дополняют дистиллированной
водой, т. е. общий объем реакционной смеси должен быть равен 30 мл).
Опытную пробу инкубируют в термостате в течение 1 ч при 30 ± 0,5° С. Для
приготовления контрольной пробы культуральный фильтрат, помещенный в
колбу, закрытую пробкой с воздушным холодильником, выдерживают в кипящей
водяной бане 1 ч для инактивации фермента. Обе пробы с помощью
потенциометра титруют из микробюретки 0,1 н. раствором щелочи до pH 7,5.
По разности между количеством щелочи, затраченной на титрование опытного
и контрольного растворов, находят количество 0,1 н. едкого натра,
необходимое для титрования освободившихся в результате действия фермента
карбоксильных групп. Значение ПЭА рассчитывают по формуле ПЭА =
ЮОаЮО/tax, где а - количество 0,1 н. едкого натра (мл); 100 - число
прогидролизованных сложноэфир-
ных связей (мкэкв), соответствующее 1 мл 0,1 н. едкого натра; 100 -
степень этерификации пектина, используемая при расчете; t - время
гидролиза (мин); a - количество ферментного препарата (г) или
культурального фильтрата (мл), взятое на анализ; х - степень этерйфи-
кации пектина, использованного в качестве субстрата.
Активность полигалактуроназ определяют обычно по увеличению количества
конечных восстанавливающих групп (в результате освобождения альдегидных
групп галактуроновой кислоты или ее полимеров), определяемых
йодометрически [393] и по снижению вязкости раствора пектина [266].
V.6.3.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОВМЕСТНОГО ДЕЙСТВИЯ ПЕКТИНЭСТЕРАЗЫ И
ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗ
Для определения активности этих ферментов разработан интер-
ферометрический метод с использованием интерферометра ИТР-2 [393]. При
этом за единицу пектолитической активности принимают количество фермента,
которое катализирует за 1 ч при pH 4,0 и температуре 30° С превращение 1
г пектина в продукты, не осаждаемые сернокислым цинком (при проведении
гидролиза в принятых условиях
7 2-6G
193
соотношение фермент - субстрат в реакционной смеси обеспечивает гидролиз
30% пектина, взятого на ферментативную реакцию). Пек-толитическую
активность выражают числом указанных единиц в 1 г (или 1 мл) исследуемого
образца.
При приготовлении субстрата используют свекловичный пектин (МРТУ 18/196-
67), содержащий не менее 70% пектина со степенью метоксилирования не
менее 35%. Для приготовления 1%-ного раствора навеску пектина, взятую с
таким расчетом, чтобы в 200 мл раствора содержалось 2 г чистого пектина
(по данным анализа), тонкой струей всыпают при непрерывном перемешивании
в коническую колбу емкостью 300 мл, куда предварительно наливают около
130 мл дистиллированной воды. Перемешивают 10 мин, после чего раствор
оставляют на 3 ч (можно на ночь) при комнатной температуре. По истечении
этого времени в раствор добавляют при перемешивании концентрированный
раствор аммиака в количестве, предварительно установленном опытным путем,
для получения значения pH 4,0. Затем раствор пектина количественно
переносят в мерную колбу емкостью 200 мл, объем доводят дистиллированной
водой до метки, тщательно перемешивают и фильтруют через два слоя марли.
Раствором можно пользоваться в течение 4 сут при условии хранения его в
холодильнике (4 - 6° С). 15%-ный раствор сернокислого цинка готовят
растворением 15 г сернокислого цинка (ZnS04 • 7НаО по ГОСТ 4174-69) в 85
мл дистиллированной воды.
Интерферометр проверяют 0,25%-ным раствором сахарозы, который наливают в
левое отделение кюветы интерферометра с длиной грани 4 см, а правое
отделение кюветы заполняют дистиллированной водой. Поправочный
