Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
фруктозы. Инвертаза проявляет сродство к Р-фруктофуранозиду,
присоединяясь к субстрату со стороны остатка фруктозы, и в этом случае
называется p-фруктофуранозидазой (Р-
D-фруктофуранозидгидролазой, К.Ф.3.2.1.26). Р-Фруктофуранозидаза способна
гидролизовать кроме сахарозы другие сахариды, содержащие свободный Р-
фруктофуранозил. Гидролиз сахарозы как со стороны а-глюкозила, или а-
глюкопиранозила, так и со стороны |3-фруктофу-ранозида приводит к
накоплению глюкозы и фруктозы (рис. 91).
Инвертаза способна переносить отщепленные остатки на другие соединения с
образованием соответствующих олигосахаридов. В таком случае а-
глюкопиранозидаза называется а-глюкозилтрансфера-зой. К этой группе
сахараз относится сахарозофосфорилаза (К.Ф.2.4.1.7), амилосахараза
(К.Ф.2.4.1.4) и декстрансахараза (К.Ф.2.4.1.5). Фермент, выполняющий
перенос остатков фруктозы, называется Р-фруктозилтрансферазой, он
участвует в синтезе фруктози-дов инулина и левана. Ферменты,
осуществляющие начальные этапы расщепления сахарозы, изучены
недостаточно. Предполагают, что ферментативная активность сахараз
обратима.
V.7.2. КАЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ
РАСЩЕПЛЕНИЯ САХАРОЗЫ
У.7.2.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕДУЦИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ В ФИЛЬТРАТАХ
КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ
При культивировании микромицетов на синтетических средах в качестве
источника углерода обычно используют сахарозу. Продукты расщепления
сахарозы накапливаются в культуральной жидкости. Анализ редуцирующих
сахаров методом бумажной хроматографии по Бояркину [75] позволяет
качественно оценить характер и скорость потребления сахарозы [328].
Рис. 91. Схема ферментативного гидролиза сахарозы [236].
198
V.7.2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ САХАРОВ В РЕАКЦИОННОЙ СМЕСИ
ПОСЛЕ ИНКУБАЦИИ С ОТМЫТЫМ МИЦЕЛИЕМ
Инкубационная среда для определения редуцирующих веществ включает 10%-ный
раствор химически чистой сахарозы, смесь солей для активации процессов
трансгексозилирования, 10% прессованного отмытого мицелия или
культуральной жидкости и 8-10% толуола. Смесь солей содержит (мг): 520 КС
1; 400 MgCl2; 220 СаС12; 400 КНС03; до 100 мл воды. Реакционную смесь
помещают в термостат при температуре 28° С. Пробы отбирают через 2,4, 24
и 48 ч и прогревают в течение 5 мин. Контролем служат пробы, прогретые до
инкубации [330]. После прогревания пробы фильтруют и анализируют состав
сахаров методом бумажной хроматографии по Бояркину [75]. Растворитель -
бутанол:пиридин:вода (3:2: 1,5), проявитель - анилин-гидрофталат.
Анилингидрофталат готовят следующим образом: 1,66 г фталевой кислоты
растворяют в 95 мл водонасыщенного я-бутанола, добавляют 0,93 г
перегнанного анилина и доводят объем раствора до 100 мл дистиллированной
водой. Хранят в темной склянке.
V.7.3. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
V.7.3.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ИНВЕРТАЗЫ
Методы определения гидролитической активности инвертазы включают два
этапа: 1) инкубация препарата фермента (внеклеточного - культуральная
жидкость или внутриклеточного - мицелий) с раствором сахарозы; 2)
определение редуцирующих сахаров либо одной глюкозы, образующейся при
расщеплении сахарозы. Активность инвертазы выражают в единицах на 1 мл
культуральной жидкости либо на 1 мг белка, содержащегося в 1 мл
культуральной жидкости.
Для определения внутриклеточной инвертазы 5 - 40 г сырого мицелия
суспендируют в 40 мл 0,15 М фосфатного буфера (pH 6,8) и разрушают одним
из трех способов: 1) растиранием замороженных клеток в фарфоровой ступке
с кварцевым песком; 2) облучением в УЗДН-1 (излучатель 35 кГц, в течение
15 мин); встряхиванием в гомогенизаторе Л-17. Полученные дезинтеграты
центрифугируют при 700 g. Осадок отбрасывают, бесклеточные экстракты
используют для определения активности внутриклеточной инвертазы.
Активность выражают в единицах на 1 г сухого мицелия или на 1 мг белка. В
инкубационную смесь вносят такое количество ферментного препарата, чтобы
расщеплению подверглось не более 5% содержащейся в растворе сахарозы. При
выполнении этого условия скорость реакции прямо пропорциональна времени и
концентрации фермента.
Последовательность определения. 1 мл фильтрата культуральной жидкости,
0,5 мл бесклеточного экстракта или раствора фермента отбирают в две
мерные колбы емкостью 100 мл. Прибавляют по 5 мл 0,5 М раствора КН2Р04 и
по 10 мл 2%-ного раствора сахарозы. Одну колбу (контрольную) кипятят в
течение 1 мин. После чего в обе колбы добавляют по 3 капли толуола и
ставят в термостат при температуре 40° С на 2 ч [368]. После инкубации
колбу с опытным раствором кипятят 1 мин, затем охлаждают и в обе колбы
для депротеинизации добавляют по 2 мл '10%-ного раствора ZnS04 и 1 мл 0,4
н. раствора NaOH.
199
Разбавляют водой до метки, взбалтывают и фильтруют через сухой фильтр в
сухую колбу.
Существуют и другие варианты реакционной смеси: сахароза (50 мкмоль),
ацетатный буфер pH 5,0 (10 мкмоль), ферментный препарат (разведение
подбирают). Инкубируют 15 мин при 38° С. Реакцию останавливают, добавляя
