Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
(до 25%), кукурузных кочерыжках (до 35%) [48, 49, 51, 56, 58, 62].
Ксиланаза (Р-1,4-ксиланксиланогидролаза, К.Ф.3.2.1.8) гидролизует р-1,3-
и Р-1,4-ксилановые связи при расщеплении ксилана,
188
образуя P-D-ксилозу. В ферментативном гидролизе ксилана участвует
комплекс ксиланаз, состоящий из эндоксиланазы, осуществляющей
неупорядоченное расщепление ксилана с образованием олигосахаридов
(разжижающая ксиланаза), и (3-ксилозидазы, гидролизующей ксиланы с
восстановленного конца цепи с образованием p-D-ксилозы (осахаривающая
ксиланаза) (рис. 88).
Ксиланы поступают в почву в значительных количествах при разложении
злаков и играют важную роль в круговороте углерода в при-
Рис. 88. Схема строения молекулы ксилана и ее ферментативный гидролиз.
роде. Ксилоза, образующаяся при гидролизе ксилана под действием
ксиланазы, служит энергетическим материалом для почвенных микро-мицетов:
фузариев, пенициллиев, триходерм, гельминтоспориев и других несовершенных
грибов, обладающих способностью синтезировать комплекс гидролитических
ферментов. При изучении ксилангид-ролизующих свойств несовершенных грибов
их выращивают на жидкой минеральной среде Чапека, где в качестве
единственного источника углерода используют химически чистый ксилан. Учет
роста грибов проводят визуально на 3-, 6- и 10-е сут [56), а в
культуральной жидкости определяют наличие продуктов гидролиза ксилана.
V.5.2. КАЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
КСИЛАНАЗ [350, 383, 384, 452]
Качественные методы определения ксиланазной активности включают
визуальную оценку интенсивности роста грибов на среде, содержащей 0,5%
ксилана, изменения субстрата и определение в культуральной жидкости
грибов состава продуктов гидролиза методом круговой бумажной
хроматографии. Эти методы подробно изложены в разделе V.4.4.I. Для
идентификации продуктов гидролиза ксилана в качестве метчиков используют
0,5%-ные стандартные растворы ксилозы, ара-бинозы и глюкозы в количестве
0,001 мл и кислотный гидролизат ксилана [269).
Y.5.3. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
КСИЛАНАЗ [140, 269, 292, 318]
Методы определения активности ксиланаз в культуральной жидкости грибов
основаны на определении в реакционной смеси содержания редуцирующих
сахаров, образующихся при гидролизе ксилана. Редуцирующие сахара
представляют собой смесь ксилоолигосахари-
189
лов и ксилозы (ксилоолигосахариды под действием р-ксилозидазы частично
гидролизуются до ксилозы), количество редуцирующих сахаров измеряют
методами йодометрического титрования по реакции восстановления меди
(метод Серенсена) или колориметрического определения с помощью реактивов
Нельсона и Шомодьи. Последний метод подробно изложен в разделе (V.4.4.1).
V.5.J.I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КСИЛОЗЫ МЕТОДОМ СЕРЕНСЕНА
Содержание ксилозы, образующейся при ферментативном гидролизе ксилана,
определяют по ее восстанавливающей активности с помощью йодометрического
титрования. В колбу Эрленмейера емкостью 50 мл, содержащую 5 мл 1%-ного
раствора ксилана, добавляют 5 мл ацетатного буфера, pH 5,4, и 1 мл
исследуемой культуральной жидкости. В контрольных пробах раствор ксилана
заменен дистиллированной водой (5 мл). Закрытые колбы помещают на 1 ч в
термостат при 42° С и через определенные промежутки времени взбалтывают.
Затем суспензию центрифугируют и отбирают по 1 мл надосадочной жидкости
для определения редуцирующей способности ксилозы.
Последовательность определения. В термостойкой пробирке с притертой
пробкой смешивают 5 мл реакционной смеси с 5 мл меднофосфатного реактива.
Пробирку закрывают и осторожно нагревают на водяной бане в течение 10
мин, а затем охлаждают. Для окисления выпавшего красного осадка закиси
меди (Си20) осторожно по стенке пробирки, не смешивая с содержимым,
добавляют 5-10 мл 0,005 н. раствора йодистого калия. Затем пипеткой с
расширенным сливным отверстием быстро приливают 1,5 мл 2 н. серной
кислоты и сразу же взбалтывают. Остаток йодистого калия оттитровывают
0,005 н. раствором тиосульфата натрия. По разнице между первоначально
внесенным и определенным содержанием йодистого калия устанавливают его
количество, вступившее в реакцию с эквивалентным количеством меди (1 мл
0,005 н. растворов Na2S203 или KJ соответствует 1 мл 0,005 н. раствора
закиси меди). Для расчета количества ксилозы в реакционном растворе
экспериментально устанавливают эквивалент 1 мг ксилозы в миллилитрах
0,005 н. раствора закиси меди. Для этого в пробирки приливают по 5 мл
раствора ксилозы (концентрация 0,2 мг в 1 мл); смешивают с 5 мл медно-
фосфатного реактива. Пробирки закрывают и нагревают на водяной бане в
течение 10 мин.
Осаждение меди и титрование тиосульфатом натрия проводят, как описано
выше. По количеству йодистого калия, израсходованного на окисление меди,
устанавливают эквивалентное количество его, выраженное в миллилитрах
0,005 н. раствора закиси меди. Например, 1 мг ксилозы соответствует 7,40
мл 0,005 н. раствора закиси меди, т. е. 1 мл 0,005 н. раствора Na2S203
