Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
1 мл реактива Нельсона, разбавляют дистиллированной водой до 25 мл и
колориметрируют при 560 нм. Интенсивность окраски опытного образца
сравнивают с контрольным. Для количественного определения глюкозы строят
калибровочную кривую в интервале измерений 5-100 мг % глюкозы.
V.4.4.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕДУЦИРУЮЩИХ САХАРОВ ОРТОТОЛУИДИНОВЫМ
РЕАКТИВОМ [262]
Принцип метода заключается в том, что глюкоза при нагревании с раствором
ортотолуидина в уксусной кислоте дает зеленую окраску. Интенсивность
окраски измеряют на ФЭКе; она пропорциональна содержанию глюкозы в
испытуемом растворе.
Реактивы: ортотолуидин технический, ледяная уксусная кислота (чда),
тиомочевина. Технический ортотолуидин требует предварительной перегонки
под вакуумом. Условия перегонки; если в системе создается вакуум 80 мм
рт. ст., температура перегонки составляет 121° С, 40 мм рт. ст. - 110° С,
30 мм рт. ст.- 103° С, 15 мм - 90° С. Полученный конденсат имеет слегка
желтоватую окраску. Хранится в склянке с притертой пробкой на холоду. На
воздухе ортотолуидин приобретает темно-вишневый цвет и становится
непригодным для использования. Реактив готовят так: в 960 мл ледяной
уксусной кислоты растворяют 10 г тиомочевины и добавляют 40 мл
перегнанного ортотолуидина. Реактив стоек и может длительно храниться.
Последовательность определения. В пробирку вносят 1 мл испытуемого
раствора, 7 мл ортотолуидинового реактива и помещают в кипящую водяную
баню на 10 мин. Затем быстро охлаждают в ледяной воде. Окраску смеси
измеряют на ФЭК-56 при 560 нм. Для количественного определения глюкозы в
испытуемых растворах строят калибровочную кривую в интервале измерений 5-
200 мг % глюкозы.
V.4.4.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ ГЛЮКОЗООКСИДАЗНЫМ МЕТОДОМ
Метод основан на следующей реакции [271]: глюкозооксидаза (|3-D-глюкоза;
02-оксидоредуктаза (К.Ф. 1.1.3.4)) избирательно переносит два атома
водорода от первого углеродного атома Р-П-глюкозы на кислород воздуха.
Пероксидаза за счет атомарного кислорода перекиси водорода окисляет
лейкоформу хромогенного акцептора кислорода. В качестве заменителя
перексидазы используют кристаллический бычий гемоглобин. При окислении
хромогенного акцептора появляется окраска, по интенсивности которой судят
о количестве окисленной глюкозы.
Реактивы: 0,9%-ный раствор NaCl; 5%-ный раствор ZnS04 • 7Н20, 0,4 н.
раствор NaOH; 1%-ный спиртовой раствор о-дианизидина; 0,4 М калий-
фосфатный буфер, pH 5,9, который готовят смешиванием 0,4 М растворов
К2НР04 и КН2Р04 в соотношении 2 : 8; препарат глюкозооксидазы;
кристаллический гемоглобин крупного рогатого скота; стандартные растворы
глюкозы - 50, 100, 150 мг%, приготовленные на насыщенном водном растворе
бензойной кислоты; 50%-ный раствор H2S04.
Состав рабочего реактива для определения глюкозы: к 15 мл 0,4 М калий-
фосфатного буфера прибавляют 1-3 мг глюкозооксидазы (табл.
187
Таблица 12. Зависимость активности препаратов глюкозооксидазы и
гемоглобина крупного рогатого скота от их количества, которое должно
содержаться в реактиве для определения глюкозы
Активность препаратов глюкозооксидазы Содержание в 1 л реактива
Активность препаратов гемоглобина (пур-пурогали-новых единиц в 1 г
препарата) Содержание п 1 л реактива
Со, ед./г препарата глюкозо- оксидазы, ед препарата глюкозо- оксидазы,
мг пероксидазы, ед. препарата гемоглобина, мг
80 000 59 500 1650 27,7 0,525 0,056 106,0
120 000 89 281 1650 18,4 0,625 0,056 83,0
180 000 133 928 1650 12,2 0,700 0,056 80,0
220 000 163 660 1650 10,0 1,00 0,056 56,0
260 000 193 437 1650 8,5 1,25 0,056 45,0
Примечание. 1 единица активности глюкозооксидазы соответствует окислению
22,4 мкл кислорода в 1 мин.
12) и 8-10 мг гемоглобина. Смесь перемешивают, прибавляют 1 мл спиртового
раствора о-дианизидина и затем дистиллированную воду до 200 мл. Реактив
хранят на холоду в темной склянке, срок хранения - до 2 нед.
Последовательность определения. В центрифужной пробирке смешивают 1,1 мл
NaCl; 0,4 мл ZnS04 • 7Н20; 0,4 мл NaOH. К смеси прибавляют 0,1 мл
испытуемого раствора или 0,1 мл стандартного раствора глюкозы,
перемешивают и центрифугируют 5 мин при п = 3000-4000 об/мин. Затем 1 мл
центрифугата помещают в мерную пробирку на 10 мл, прибавляют 3 мл
рабочего реактива. Смеси перемешивают и инкубируют 30 мин в водяной бане
при 45°С. По окончании инкубации пробирки переносят в ледяную воду,
охлаждают и тут же приливают 50%-ную H2S04 до 10 мл. Появляется
стабильная вишневокрасная окраска. Ее интенсивность измеряют на ФЭКе с
зеленым светофильтром против контроля (1 мл воды + 3 мл реактива +
H2S04). Концентрацию глюкозы определяют по стандартной кривой, выведенной
со стандартными растворами глюкозы - 50, 100, 150 мг%.
V.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КСИЛАНАЗ
V.5.I. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Ксиланы входят в состав гемицеллюлоз и представляют собой полипентозаны,
образованные из остатков P-D-ксилопиранозы (С5Н10Об), соединенных между
собой 1,3- и 1,4-связями. Ксиланы содержатся в соломе (до 20%), древесине
