Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
1 л воды в присутствии 20 мл 0,1 н. H2S04. Исходный раствор разбавляют в
10 раз кислотой. В 5 мл разбавленного раствора содержится 0,04 мл
фосфора. Эйконоген растворяют в 125 мл смеси, состоящей из 59,5 г NaHS03
и 2 г безводного Na2S03 в 250 мл дистиллированной воды, и доводят водой
до 200 мл. Раствор эйконогена может храниться в склянке с притертой
пробкой до 2 нед. Активность фермента выражают количеством фосфора (мг),
освободившегося под действием фермента за единицу времени.
Если гидролиз сахарозы происходит в присутствии акцептора фруктозного
остатка, инвертаза обнаруживает трансферазное действие [338].
V.7.3.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ДЕКСТРАНСАХАРАЗЫ
И АМИЛОСАХАРАЗЫ
Этот фермент образует декстраны из глюкозных единиц, освобождающихся при
расщеплении сахарозы, перенося их на растущие дек-страновые цепи.
Состав реакционной смеси для определения декстрансахаразы (са-харозо-6-
глюкозилтрансферазы) : 100 мг клеток, 20 мл 300 мкМ раствора сахарозы и
ацетатный буфер (pH 5,0). Инкубацию проводят при температуре 25° С. Учет
активности декстрансахаразы осуществляют по количеству освободившейся
фруктозы, которое эквивалентно
201
количеству глюкозных единиц, вошедших в декстран. Для определения
количества D-фруктозы используют различные реакции на кетосахара, в
частности антроновый метод [443], основанный на том, что сахара в
сильнокислой среде образуют фурфурольные производные сине-зеленой
окраски. Антроновый реактив готовят так: 0,05 г антрона растворяют в 100
мл 66%-ной (по объему) хч H2S04 при нагревании на водяной бане, затем
раствор быстро охлаждают. В большие пробирки из термостойкого стекла
размером 20 X 200 мм вносят по 1 мл испытуемого раствора, содержащего 25-
125 мкг сахара и добавляют по 10 мл свежеприготовленного раствора
антрона. Нагревают 10 мин на кипящей водяной бане. Растворы охлаждают и
через 5 мин колориметрируют.
Следует отметить, что растворы глюкозы, фруктозы и других сахаров
одинаковой концентрации дают при реакции с антроном равноценные изменения
оптической плотности, измеряемые на ФЭКе при 630 нм с красным
светофильтром. Поэтому для всех сахаров используется одна калибровочная
кривая, составленная по глюкозе с концентрацией 5-12 мг%. С помощью
антронового метода можно определять содержание сахаров с точностью 0,5-
1,0%. За единицу активности декстрансахаразы принимают количество
фермента, необходимое для образования 1 мкмоль фруктозы за 1 мин. Принцип
определения активности амилосахаразы (сахарозо-4-глюкозилтран-сферазы)
аналогичен.
V.7.3.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЛЕВАНСАХАРАЗЫ И ИНУЛАЗЫ
Состав реакционной смеси для определения активности левансаха-разы
(сахарозо-6-фруктозилтрансферазы; К.Ф.2.4.1.10) : 1-2 мл исследуемой
пробы и 1 мл раствора сахарозы в 0,2 М фосфатном буфере (pH 5,3).
Инкубацию проводят при 30° С в течение 30 или 120 мин в зависимости от
степени левансахаразной активности культуральной жидкости или
бесклеточного экстракта.
В процессе синтеза левана увеличивается оптическая плотность реакционной
смеси. Причем количество синтезированного левана пропорционально
оптической плотности реакционной смеси, как пропорционально ей и
количество глюкозы, освобождающейся из сахарозы в ходе левансахаразной
реакции. Это совпадение позволяет оценивать активность левансахаразы по
изменению оптической плотности реакционной смеси в результате инкубации,
а активность ее выражать в микромолях глюкозы [484]. Для определения
глюкозы используют глюкозооксидазный метод. За единицу активности
левансахаразы принимают количество фермента, содержащееся в 1 мл
культуральной жидкости или в 1 мг сухого мицелия, которое катализирует
образование 1 мкмоля глюкозы за 1 мин.
Активность инулазы (сахарозо-1-фруктозилтрансферазы;
К.Ф.2.4.1.9) определяют по такому же принципу [433].
V.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ НУКЛЕАЗ
У.8.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Высокая биохимическая активность грибов связана с выработанным в процессе
эволюции у них и ряда сапрофитных бактерий "внешним" пищеварением или
осмотрофным питанием [163], которое невоз-
202
можно без секреции пищеварительных гидролитических ферментов в окружающую
среду. Класс гидролаз включает фосфогидролазы, к которым по классификации
ферментов 1972 г. относятся и РНКазы.
Все ферменты, участвующие в расщеплении НК, называются нук-леазами. Они
включают ферменты, специфичные для ДНК (ДНКазы) и РНК (РНКазы), и большую
группу ферментов, способных расщеплять оба типа молекул НК,- нуклеазы
[23, 24]. По механизму действия нуклеазы подразделяют на две группы:
фосфотрансферазы и фосфогидролазы.
Фосфотрансферазы используют 2'-ОН группу рибозы для расщепления фосфо
диэфир ной связи, в результате чего образуются циклические 2',3'-диэфиры,
которые затем гидролизуются до соответствующих нуклеозид-3'-монофосфатов.
К ним относятся только истинные (циклизующие) РНКазы.
Фосфогидролазы в отличие от фосфотрансфераз катализируют прямое
расщепление 3', 5'-фосфодиэфирной связи водой. К ним относятся ферменты,
