Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
7. При выборе амфолинов определенных диапазонов pH следует учитывать, что
с их помощью не всегда можно получить строго линейный градиент pH с
равномерным распределением напряжения по всему указанному рабочему
диапазону (Vester-berg, 1975). Соответственно иногда есть смысл усилить
определенные участки градиента с помощью амфолитов узкого диапазона pH.
Так, в работе Vesterberg, 1973с, рекомендуется к ам-фолинам широкого
диапазона pH 3,5-10 добавлять немного амфолинов pH 9-11 для поддержания
линейности в щелочной области градиента. В этой же работе предлагается
дополнительно вводить добавки амфолинов pH 4-6 и 5-7 для более
равномерного распределения падения напряжения. Можно также специально
трансформировать линейный градиент, делая определенные его участки более
пологими, за счет добавок амфолинов узких диапазонов pH. Это позволяет
повысить разрешение в области фокусирования особенно интересных для
исследователя компонентов, сохраняя полную картину распределения других
компонентов в прежнем виде.
3.2.10. Выбор электродных растворов
В качестве анолита и католита обычно используют растворы нелетучих
свободных кислот и оснований соответственно. При ИЭФ в пластинах геля
рекомендуется, как правило, применять более концентрированные электродные
растворы по сравнению с теми, что обычно используют при ИЭФ в трубках.
Это связано с тем, что в аппаратах для ИЭФ в горизонтальных пластинах в
роли электродных камер выступают просто две полоски толстой
фильтровальной бумаги, пропитанные анолитом и католитом. В большинстве
случаев в качестве соответствующих электродных растворов подходят 1 М
фосфорная кислота и 1 М
Аналитическое ИЭФ
19?
гидроксид натрия. Фирма Bio Rad в своем техническом бюллетене № 1030
(1975 г.) в качестве католита рекомендует растворг содержащий смесь NaOH
и Са(ОН)2. Присутствие Са(ОН)2, образующего нерастворимый СаС03,
предотвращает попадание в гель карбонат-ионов, которые образуются в
щелочной среде из растворенного С02. Хотя растворы сильных кислот и
оснований могут с успехом использоваться в качестве электролитов при ИЭФ
в различных диапазонах pH, часто лучших результатов удается достичь,
применяя электролиты другого типа, в частности амфолиты граничных
диапазонов pH. Так, в работе Vesterberg, 1975, для получения максимально
пологого градиента pH в геле, содержавшем амфолины pH 5-7, в качестве
аноли-та и католита использовались 1%-ные амфолины диапазонов pH 4-6 и 6-
8 соответственно. В табл. 3.2 перечислены электродные растворы,
рекомендуемые фирмами LKB, Pharmacia " Bio Rad. Из таблицы видно, что для
случая ИЭФ в широком диапазоне pH 3-10 все фирмы рекомендуют сильные
основания и сильные кислоты, а для ИЭФ в узких диапазонах - более слабые
электролиты или смеси амфолитов-носителей. При фокусировании в трубках с
ПААГ электролиты следует разбав-
/
Таблица 3.2. Электродные растворы для ИЭФ в пластинах геля
Диапазон pH Анод (+) Катод (-)
LKB
3,5-9,5 1 M H3P04 I М NaOH
2,5-6 1 М НзРО* 0,5%-ные амфолины pH 5-7
5-8,5 (0,1-1,0) МН3РО4 или!%-ные (0,1-1) М NaOH или 10%-ные
7,5-10,5 амфолины pH 5-7 амфолины pH 8-10
0,1%-ные амфолины pH 7-9 1 М NaOH
Pharmacia
3-10 40 мМ аспарагиновая кислота 1 М NaOH
2,5-5 0,1 М H2S04 0,2М гистидин или 0,1 М NaOH
4-6,5 40 мМ глутаминовая кислота 0,2 М гистидин
5-8 40 мМ глутаминовая кислота 1 М NaOH
6,5-9 0,25 М HEPES1) 1 М NaOH
8-10,5 0,25 М HEPES 1 М NaOH
Bio Rad
3-10 I N Н3Р04 1 М NaOH
2,9-5,0 1 N Н3РО4 2%-ные биолиты pH 6-8
3,7-6,2 1 N Н3РО4 1 М NaOH
4,4-7,2 1 N Н3РО4 1 М NaOH
5,6-8,2 2%-ные биолиты pH 4-6 1 М NaOH
7,3-9,5 1 N HEPES 1 М NaOH
8,2-10,0 1 N HEPES 1 М NaOH
J) HEPES - К-2-гидроксиэтилпиперазин*М'-2-этансульфокислота.
102
Глава 3
лять до концентрации не выше 0,1 М, т. е. ровно настолько, чтобы
сохранить достаточно высокую электропроводность и избежать значительного
падения напряжения на участке между электродами и гелем. В литературе
имеется одно сообщение об использовании аммонийного буфера с pH 10 в
качестве католита и ацетатного буфера с pH 4 в качестве анолита (Swanson,
Sanders, 1975), но мне кажется, что такой подход противоречит принципу
изоэлектрического фракционирования.
При ИЭФ в горизонтальных пластинах электродные полоски следует смочить
соответствующими растворами и лишь затем помещать их на поверхность геля.
Следует обратить внимание на равномерность смачивания. Удобный и
эффективный прием заключается в том, что полоски кладут на стекло и при
помощи пипетки вводят определенный объем электролита между стеклом и
полоской. Это гарантирует равномерное смачивание и удаление пузырей
воздуха из полоски. Смоченную полоску следует промокнуть фильтровальной
бумагой для удаления избытка жидкости. Полоска должна быть с виду почти
сухой, так как избыток католита или анолита может привести к образованию
"затеков" на поверхности геля и к заметным искажениям градиента pH.
3:2.11. ИЭФ в пластинах ПААГ
В этом разделе будут рассмотрены методические основы и приборное
