Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
заполнение формы рабочим раствором мономеров, временно снимают два
верхних зажима и вставляют между стеклами две канцелярские скрепки. После
заливки необходимого объема раствора скрепки снимают, а зажимы ставят на
место, так что жидкость доверху заполняет форму. (Gorg et al., 1978.)
щиной 120, 240 или 360 мкм могут быть получены с использованием в
качестве уплотнительной прокладки П-образной рамки, вырезанной из одного,
двух или трех слоев обычного лабораторного парафильма. Сборка формы для
заливки геля показана на рис. 3.15. Толстую стеклянную пластинку (3 мм)
смачивают водой, накладывают сверху полиэфирную пленку и накатывают с
помощью резинового валика (см. рис. 3.7); ставят П-образную прокладку и
сверху закрывают еще одной пластинкой. Верхнюю пластинку, если она
стеклянная, для облегчения последующего удаления следует покрыть слоем
реагента Photo Flow (фирмы Kodak) или 0,01%-ного раствора детергента типа
Nonidet Р-40. Я предпочитаю использовать пластину из толстого оргстекла
(0,8-1 см), высота которой (при* вертикальном расположении собранной
формы) на 2 см больше высоты стеклянной пластины с полиэфирной подложкой.
Это значительно облегчает заполнение камеры и позволяет легко разобрать
форму, не нарушив сцепления геля с подложкой (см. также рис. 3.8,5). Для
облегчения заполнения формы (что в случае приготовления гелей с толщиной
120 или 240 мкм оказывается непростым делом) пользуются также следующим
приемом: снима-
Глава 3
ют два верхних зажима и между стекол с двух сторон вставляют канцелярские
скрепки. Это дает возможность ввести во внутреннее пространство иглу
шприца, содержащего рабочий раствор мономеров (рис. 3.16). После удаления
скрепок зажимы ставят на место, и жидкость в форме поднимается до нужного
уровня.
Метод ИЭФ в ультратонких гелях обладает рядом важных преимуществ:
(а) он характеризуется значительно большей разрешающей способностью, чем
ИЭФ в обычных гелях;
(б) эффективность теплоотвода существенно выше, что позволяет
использовать более высокие напряжения и получать более узкие зоны, чем
при ИЭФ в 1-2-мм пластинах;
(в) фиксация гелей на полиэфирной подложке, предохраняя от разрывов,
делают их очень удобными в обращении на всех этапах работы;
(г) все операции по окрашиванию, удалению фона и высушиванию занимают
меньше времени, чем в случае обычных гелей;
(д) расходуется значительно меньше амфолитов и других реактивов;
(е) можно очень быстро (за несколько минут) получать зимо-граммы,
благодаря чему практически не происходит диффузионного уширения
сфокусированных зон.
Для получения более тонких гелей, порядка 50-100 мкм, в работе Radola,
1980а,b был предложен модифицированный вариант заполнения формы - метод
выдавливания (flap technique). Залить такой тонкий гель обычным способом
практически невозможно. Суть этого метода заключается в следующем: на
горизонтальную стеклянную пластину, оснащенную соответ-
Рис. 3.17. Приготовление геля методом выдавливания (flap technique). 1 -
прокладки толщиной 50 или 100 мкм, 2 - стеклянная пластина, обработанная
реагентом Silane А-174, или полиэфирная пленка, 3 - нижняя стеклянная
пластина, 4 - рабочий раствор мономеров, 5 - верхняя стеклянная пластина,
б - верхняя полиэфирная гидрофилизованная пленка толщиной 100 мкм,
несколько выступающая за край пластины, для облегчения извлечения
готового геля.
(Radola, 1980а.)
Аналитическое ИЭФ
205
ствующими прокладками, выливают рассчитанный объем рабочего раствора
мономеров. После этого постепенно опускают верхнюю пластину таким
образом, чтобы жидкость распределилась ровным сплошным слоем между двумя
поверхностями (см. рис. 3.17). Образующийся тонкий слой геля можно
зафиксировать на полиэфирной пленке или ковалентно "пришить" к стеклянной
поверхности с помощью силанольного производного (ме-
такрилоксипрооилтриметоксисилана):
ОСНз сн3
I I
СН3-0-Si-CH2-CH2-СН2-0-С-С =снг
осн3 о
В этом случае действительно реализуется ковалентное связывание геля за
счет образования силанольных мостиков
I I
-Si-О-Si-
I 1
между одним концом молекулы реагента и поверхностью стекла. Метакрилатная
группировка на другом конце молекулы вступает в сополимеризацию с
мономерными компонентами ПААГ. Этот реагент можно приобрести у фирмы
Pharmacia под маркой Silane А-174, у фирмы Desaga под маркой Polyfix 1000
или непосредственно у фирмы-изготовителя (Union Carbide, Sisterville
plant, West Virginia, USA) по цене несколько долларов за галлон (~4,5 л).
Ковалентная "пришивка" к стеклу с помощью Silane А-174 была использована
в работе Bianchi Bosisio et al., 1980, при работе с очень ломкими гелями
с высоким содержанием сшивки (биса). Я же могу предложить следующую
методику: готовится 0,2%-ный раствор Silane А-174 в безводном ацетоне.
Непосредственно перед полимеризацией геля тонкую чистую стеклянную
пластину погружают в раствор на 30 с, вынимают, дают раствору стечь и
держат на воздухе до обсыхания. Раствор реагента можно хранить в темноте
