Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
пределах этого диапазона) приходится заметно увеличивать время
фокусирования. Белки
с Мг< 100 ООО фокусируются достаточно быстро. Эти гели также не очень
прочны и требуют весьма осторожного обращения. Поскольку мол. масса
большинства известных белков в действительности не превышает 200 000,
часто можно пользоваться более прочными гелями с 7=5% и С=4%. С гелями
такого, по сути дела, оптимального состава легко манипулировать при
окрашивании и сканировании.
Другое важное требование при ИЭФ в ПААГ заключается в необходимости
получения градиента pH, достаточно стабильного для того, чтобы все белки
могли достичь своих равновесных положений, преодолев сопротивление
матрицы. Поскольку положение сфокусированного белка, естественно, зависит
от формы конкретного профиля pH, очень важно добиться получения
воспроизводимых градиентов pH в геле. При работе с нестабильными и
невоспроизводимыми градиентами весьма непросто сопоставлять картины
разделения, полученные в различных опытах или с различными партиями
номинально одинаковых препаратов амфолитов-носителей.
Мы установили, что для получения стабильного градиента pH при ИЭФ в ПААГ
концентрация амфолитов-носителей в геле должна быть не ниже 2%. При более
низких концентрациях (особенно при концентрациях ниже 1%) градиент pH в
геле, как правило, нестабилен (Finlayson, Chrambach, 1971; Righetti,
Drysdale, 1971). В таких гелях часто возникают локальные перегревы. По-
видимому, общее содержание амфолитов-носителей должно быть не ниже
определенного уровня, при котором все соседние зоны сфокусированных
амфолитов перекрываются настолько, чтобы обеспечить достаточно хорошую
электропроводность по всему градиенту pH. Концентрация амфолитов также
Аналитическое ИЭФ
187
должна быть достаточной и для того, чтобы перекрыть буферную емкость
белков, сконцентрированных в пределах своих зон фокусирования.
Желательно, чтобы удельная буферная емкость амфолитов при pH вблизи pi
была не ниже 0,3 мкэкв/мг (Vester-berg, 1973с). Помимо всего прочего,
следует обратить особое внимание на те случаи, когда область pH около 7
не входит в рабочий диапазон pH разделения. При этом сам рабочий раствор
не содержит амфолитов, обладающих буферными свойствами при pH 7, однако
участок с pH 7 с неизбежностью должен появиться возле одного из
электродов. Для того чтобы избежать чрезмерного падения напряжения на
таком участке и, следовательно, "недофокусирования" на других участках
градиента, в гель дополнительно вводят небольшое количество амфолитов
диапазона pH 3-10 или 6-8 (Haglund, 1971).
3.2.9. Полимеризация геля
В этом разделе будут рассмотрены общие аспекты процесса полимеризации,
относящиеся к приготовлению как плоских, так и цилиндрических гелей.
Более подробная информация по кинетике полимеризации в зависимости от
применения различных типов сшивающих агентов, катализаторов и температуры
содержится в публикациях Gelfi, Righetti, 1981a,b, и Righetti et al.,
1981c.
Для приготовления ПААГ используются следующие реактивы:
перекристаллизованный акриламид и бис (или "сшивка" любого другого типа,
за исключением ДАТД), N,N,N',N'-TeTpa-метилэтилендиамин (ТЕМЭД),
персульфат аммония (или калия), рибофлавин или рибофлавин-5-фосфат
(флавинмоно-нуклеотид - ФМН), амфолиты-носители и при необходимости такие
добавки, как сахароза, сорбитол, глицерин, мочевина, нейтральные или
цвиттерионные детергенты. Для полимеризации готовят следующие исходные
растворы:
Раствор мономеров 28,8 г акриламида и 1,2 г бис на
100 мл раствора в дистиллированной воде (Т-30%, С = 40%)
Амфолиты-носители 40%-ные растворы (за исключением
амфолитов pH 2,5-4 и 9-11 с концентрацией 20%)
ТЕМЭД 10%-ный водный раствор
Персульфат аммония 40%-ный водный раствор (готовят
заново каждую неделю)
Рибофлавин (или ФМН) 4 мг/100 мл воды
Следует помнить, что акриламид в мономерной форме является нейротоксином,
поэтому работать с ним следует, не допу-
188
Глава 3
ская попадания его на кожу. Как правило, нет необходимости независимо
готовить растворы, содержащие отдельно акриламид и отдельно бис, за
исключением тех случаев, когда применяют гели с очень высоким содержанием
"сшивки". Растворы акрила-мида и рибофлавина портятся на свету, поэтому
их следует хранить в посуде, обернутой алюминиевой фольгой {проста темное
стекло не обладает достаточным защитным действием) при 4 "С. Нежелательно
хранить исходный раствор мономеров дольше одного месяца, поскольку
акриламид в растворе медленно гидролизуется с образованием свободной
акриловой кислоты.
Последовательность операций 1. Заливают нужный объем раствора,
содержащего мономеры (обычно 5-6% Т и 4% Свис или 4% Сбац или 4% Сдгэба)
и амфолиты-носители (обычна 2%), в коническую колбу с боковым отростком
(колбу Бунзена).
2. Закрывают колбу и тщательно деаэрируют раствор, подсоединив на 5 мин к
водоструйному или масляному вакуумному насосу. Для лучшей
воспроизводимости я предпочитаю пользоваться масляным насосом,
