Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
заимствованы из методической разработки Saravis, Cook, 1979, с любезного
разрешения фирмы
Marine Colloids.)
12*
180
Глава 3
15°С вместо 4°С (Vesterberg, 1980). Однако, по-видимому, это •относится
только к первым партиям агарозы типа IEF, которые еще не были достаточно
хорошо "сбалансированы". При использовании выпускаемой в настоящее время
продукции остаточный катодный дрейф должен быть значительно менее
ощутимым. По окончании ИЭФ гель быстро фиксируют в 5%-ном водном растворе
ТХУ, содержащем 33% метанола и 3,'5% сульфосалициловой кислот#. Подле
фиксации агарозный гель на подложке высушивают, проводя последовательно
операции, которые проиллюстрированы на рис. 3.9. Поверхность геля
покрывают листом фильтровальной бумаги, на который кладут еще несколько
слоев фильтровальной бумаги, и выдерживают такой "сэндвич" под грузом
(0,5-1 кг). Затем с помощью фена полностью высушивают гель и снимают
прилегающий к поверхности геля лист бумаги с помощью процедуры "быстрого
смачивания" (этапы 3 и 4 на рис. 3.9). На этом этапе высушенную агарозную
пленку
Рис. 3.9. Методика высушивания агарозного геля после ИЭФ для последующего
окрашивания. После фиксации в ТХУ гель прижимают к стопке листов
фильтровальной бумаги с помощью груза (0,5-1 кг/дм2) (этап .1). Гель
окончательно подсушивают феном (этап 2). Лист фильтровальной бумаги
удаляют с поверхности агарозной пленки с помощью процедуры "быстрого
смачивания" (этапы 3 и 4). (Из методической разработки Saravis, Cook,
1979, с любезного разрешения фирмы Marine Colloids.)
Аналитическое ИЭФ
181
можно быстро окрасить и отмыть от фона. Можно пользоваться обычными
красителями типа кумасси или, как предлагается в работе Saravis et al.,
1980, применять метод, описанный Crowle, Cline, 1977 [2,5 г кроцеинового
алого (Crocein Scarlet), 150 мг кумасси ярко-синего (Coomassie Brilliant
Blue, СВВ R-250), 50 мл ледяной уксусной кислоты и 30 г ТХУ на 1 л
раствора].
При ИЭФ белков в денатурирующих и (или) восстанавлива-. ющих условиях, т.
е. в присутствии 8-9 М мочевины и (или) меркаптоэтанола, было бы лучше
всего использовать крупнопористую матрицу типа агарозной, поскольку в
результате разворачивания белковых глобул их стоксов радиус заметно
возрастает (Creighton, 1979). В то же время присутствие мочевины -
типичного агента, разрывающего водородные связи, - отрицательно
сказывается на свойствах агарозного геля, в структуре которого
существенную роль играет именно разветвленная система водородных связей.
Эту проблему удается разрешить за счет повышения концентрации агарозы в
геле от 0,8, до 2%. Рабочий раствор, содержащий 2%-ную агарозу, 8 М
мочевину, а также 10%-ный сорбитол, заливают в форму и выдерживают 15-20
ч при 21'"С (Olsson, LaSs, 1981). Для предотвращения карбамилирования
белковых аминогрупп цйа-нат-ионами, равновесная концентрация которых в 8
М мочевине при 20"С и рН>6 достигает 20 мМ, в гель можно вводить 1%-ный
меркаптоэтанол, эффективно блокирующий цианат-ионы.
Гели на основе агарозы IEF могут иметь самое разнообразное применение.
Так, с помощью иммунопероксидазного метода удавалось зарегистрировать
сфокусированные в агарозном геле антигены при очень высоком разбавлении
антител (< 1:2500) (Saravis et al., 1980b). При необходимости
чувствительность можно повысить еще в 100 раз, используя прочность
комплекса между авидином и биотином. В образовании специфического
комплекса при этом участвуют биотинилированные вторичные антитела, авидин
и биотинилированная пероксидаза хрена. Поскольку этот комплекс намного
стабильнее, чем использовавшийся в первом случае конъюгат пероксидазы с
антителами козы против мышиных иммуноглобулинов, для обнаружения
сфокусированных антигенов оказывается, достаточным использовать первичные
антитела с разбавлением 1:250 000.
Агарозные гели успешно применяются и для перекрестного
иммуноэлектрофокусирования. Суть данного метода заключается в том, что на
первой стадии проводят обычное ИЭФ белков, а на второй -
иммуноэлектрофорез в перпендикулярном направлении в содержащем антитела
агарозном геле. Ранее, когда первую стадию приходилось проводить в
полиакриламидном
182
Глава 3
геле, для осуществления второй стадии полоску ПААГ после ИЭФ просто
накладывали на агарозную пластинку с антителами (Soderholm et al., 1975).
Сейчас, когда стало возможным проводить ИЭФ в агарозе, полоску агарозы
после фокусирования можно вплавить в агарозную пластину второго
направления, что позволяет получать более воспроизводимые результаты.
Наконец, ИЭФ в агарозе может быть использовано в сочетании с ДДС-Иа-
электрофорезом во втором направлении для получения рГ/Мг-белковых карт,
аналогично классическому методу O'Farrell, 1975. В этом случае применение
агарозного геля на первой стадии позволяет надеяться на то, что при ИЭФ
даже очень крупные белки смогут достигнуть своих равновесных положений
(pi). Это в свою очередь должно повысить воспроизводимость метода.
