Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
dukter АВ.)
шпателем и упираясь, как рычагом, в нижнюю пластину (рис. 3,12). Очень
важно не нарушить сцепления геля с нижней пластиной, поскольку это может
вызвать локальное изменение электропроводности и искажение градиента pH.
После удаления верхней пластины на поверхность геля накладывают полоски
толстой фильтровальной бумаги, смоченные католитом и аноли-том (как
описано в разд. 3.2.10). Необходимо проконтролировать, чтобы эти полоски
были наложены ровно, параллельно и на таком расстоянии друг от друга,
чтобы при опускании крышки проволочные платиновые электроды (для
аппаратов, в которых электроды жестко фиксированы на крышке) приходились
в точности на середину электродных полосок. Для этого к большинству
моделей аппаратов этого типа прикладываются трафаретные сетки,
ориентируясь на которые можно точно расположить электродные полоски.
После этого пластину геля помещают на поверхность блока охлаждения. Для
эффективного теплоотвода желательно, чтобы между пластиной и охлаждаемой
поверхностью находился слой жидкости. Для этого нижнюю поверхность
пластины и поверхность блока охлаждения смачивают водным раствором
какого-либо неионного детерген-
Аналитическое ИЭФ
199
та; можно использовать также керосин или легкое парафиновое масло.
Пластину следует накладывать на смоченную поверхность постепенно, таким
образом, чтобы формировался ровный сплошной промежуточный слой жидкости,
не содержащий пузырьков воздуха (рис. 3.13).
Полимеризация геля может осуществляться и в горизонтальном положении,
например, так, как это предусмотрено фирмой Bio Rad, предлагающей
специальный лоток для заливки геля. На рис. 3.14,А проиллюстрирован
процесс заполнения формы, а на рис. 3.14,5 - вертикальный разрез лотка с
гелем. Лоток, сделанный из пластика, оснащается несколькими парами
боковых прокладок различной толщины - от 0,5 до 2 мм. Сверху на прокладки
кладут стеклянную пластину (рис. 3.143)" получая таким образом камеру
желаемых размеров. Рабочий раствор мономеров аккуратно заливают в камеру,
перемещая пипетки вдоль кромки стекла. Жидкость заполняет камеру под
действием как собственного веса, так и капиллярных сил. Аналогичный
принцип используется сейчас и фирмой LKB в наборе для капиллярной заливки
гелей ("Capillary gel casting kit"), в который входят стеклянные пластины
толщиной 3 мм с прикле-
А
Гель Стеклянная пластинка
1 = ш
/У/s- Ш
Акриловый лоток Ограничительная прокладка
Б
Рис. 3.14. А. Процесс подготовки геля с использованием камеры фирмы Bio
Rad. Раствор акриламида медленно заливают в зазор между пластиной и
лотком, перемещая кончик пипетки вдоль края пластины. Б. Вертикальный
разрез камеры для полимеризации геля. (Из методического руководства Bio
Rad Labs.)
200
Глава 3
енными по бокам 0,5-мм прокладками из поливинилхлорида. Сверху на такую
форму накладывают другую стеклянную пластину, которая на 20 мм короче
нижней, что позволяет легче заполнить 0,5-мм щель между пластинами только
за счет капиллярных сил. Подробное описание этой методики приведено в
работе Esen, 1981. Горизонтальный способ заливки особенно эффективен для
приготовления ультратонких гелей. За дополнительной информацией по ИЭФ в
пластинах геля читатель может обратиться к публикациям Davies, 1975;
Karlsson et al., 1975, и Vesterberg, 1975.
Выделим еще несколько общих методических положений.
1. Эффективность охлаждения (отнесенная к единице поверхности геля)
зависит от материалов, из которых изготовлены подложка геля и блок
охлаждения (предлагалось использовать блоки из оксида бериллия, как в
тепловых щитах, применяемых компанией NASA).
2. Наиболее эффективное охлаждение достигается при максимальном отношении
площади поверхности к объему геля.
3. Чем толще слой геля, тем больше тепла будет выделяться в нем при любой
фиксированной разности потенциалов. Таким образом, предпочтительнее всего
проводить ИЭФ в тонкой пленке геля, вследствие чего и началось развитие
техники работы с ультратонкими гелями (разд. 3.2.13).
4. Чем ниже температура охлаждающей жидкости, тем выше допустимая
электрическая нагрузка на гель.
5. Сила тока в геле непосредственно зависит от рабочей концентрации
амфолитов-носителей. Как уже упоминалось, в большинстве случаев для
получения плавного и стабильного градиента pH необходимо, чтобы
концентрация амфолинов была не ниже 2%. Различного рода добавки типа
сахарозы могут повышать сопротивление геля из-за увеличения вязкости.
6. При установлении величины электрической нагрузки следует
ориентироваться на такой параметр, как падение напряжения на единицу
длины пути разделения. Таким образом, при ИЭФ вдоль пластины геля можно
прикладывать более высокое напряжение, чем при ИЭФ в поперечном
направлении.
7. Как уже отмечалось, напряженность электрического поля далеко не всегда
равномерно распределяется по всему гелю. При использовании амфолинов
широкого диапазона pH 3,5-10 на начальных стадиях ИЭФ в областях,
