Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
(например, в случае, полимеризации акриламида) образуют долгоживущие
свободные радикалы; (в) агарозная матрица очень удобна для проведения
иммунофиксации или иммунофореза после ИЭФ; (г) агарозные гели быстро и
эффективно окрашиваются, отмываются от фона и легко могут быть высушены
для хранения. (Как будет показано далее, свойства последней группы
характерны и для используемых в настоящее время ультра-тонких
полиакриламидных гелей.) Простоте приготовления и
Гидрофилизованной стороной наверх
' * . . "4Е
/ А Б
Рис. 3.7. Наложение (А) и накатывание (Б) пленки типа Gelbond на
регулируемый по уровню столик для заливки агарозного геля. (С любезного
разрешения фирмы Marine Colloids, из методической разработки Saravis,
Cook, 1979.)
12-1488
178
Глава 3
манипуляций с агарозными гелями способствует применение прозрачных гибких
полиэфирных подложек (например, Gel Bond фирмы Marine Colloids), у
которых одна из поверхностей гид-рофилизована для улучшения сцепления с
гелем. Подложки этого типа выпускаются в виде листов или рулонов с
толщиной пленки 0,1 мм (гибкая) или 0,2 мм (полужесткая). С моей точки
зрения, лучше покупать готовые листы, поскольку куски нужного размера,
отрезанные от рулона, имеют тенденцию к скручиванию.
Для приготовления агарозного геля подложку (обычно размером 12,5X12,5 см)
накладывают на выверенный по уровню горизонтальный столик, гидрофобной
стороной вниз (та сторона, на которой капля воды не растекается), и при
необходимости накатывают резиновым валиком для удаления пузырей воздуха
(рис. 3.7Л,5). Для того, чтобы избежать слишком быстрого' теплоотвода при
контакте с металлической поверхностью столика, что могло бы привести к
неравномерному застыванию геля, предлагается между столиком и подложкой
проложить лист термоизолятора - пористого полистирола (из инструкции в
¦брошюре фирмы LKB). Для ИЭФ можно использовать раствор агарозы любой
концентрации в диапазоне 0,5-1,25%. Однако, ввиду того что гели с более
высокой концентрацией агарозы лучше удерживают воду, оптимальной рабочей
концентрацией можно считать 0,8%, при которой пористость агарозного геля
-еще достаточно высока (170 нм). Нужный объем раствора агарозы кипятят на
водяной бане в течение 10 мин (можно кипятить и заведомо больший объем,
затем разливать аликвоты по пробиркам и хранить при 4°С, а перед
употреблением расплавлять). Для предотвращения упаривания раствора колбу
при кипячении следует закрывать охлаждаемым стеклянным пальцем или просто
перевернутым небольшим стаканчиком (парафильм для этой цели не подходит,
поскольку он плавится или рвется!). После полного растворения агарозы
колбу выдерживают в водяной бане с температурой 56-58 °С, добавляют
рассчитанное количество нагретого раствора амфолитов-носителей (до
концентрации 2,5%) и выливают все содержимое на горизонтально
установленную подложку типа Gel Bond (см. рис. 3.8,Л). Объем рабочего
раствора выбирают таким, чтобы получить гель толщиной около 1 мм. Для
заливки более тонких гелей (например, 0,8 мм) лучше пользоваться
вертикальной формой, которая обычно применяется для полимеризации
полиакриламидных гелей (рис. 3.8,5). При этом удается избежать
образования неравномерного по толщине слоя (особенно у краев). На одной
из внутренних поверхностей формы для заливки должна находиться подложка
Gel Bond. Всю форму перед заливкой раствора агарозы следует подогреть.
Готовые пластины обычно выдер-
Аналитическое ИЭФ
17"
живают в течение ночи при 4°С для старения геля и повышения его
механической прочности. Однако высказывалось мнение (Saravis et al.,
1980а), что лучше выдерживать гель при комнатной температуре во избежание
синерезиса ("усадки" геля с вытеснением воды), который иногда наблюдается
в процессе хранения геля при 4°С. Образцы наносят или в виде капель (по 3
мкл) прямо на поверхность геля, или с помощью смоченных кусочков
фильтровальной бумаги (типа Paratex, LKB 2117-ЮЗ), или через прорези
шаблона, изготовленного из материала типа Mylar (толщиной 52 мкм). При
анализе биопсийного материала на поверхность геля можно непосредственно
накладывать тканевые срезы (Saravis et al., 1979).
Фокусирование обычно продолжается 60 мин при постоянной мощности 10 Вт; к
концу процесса напряжение возрастает до 1100 В (Vesterberg, 1980).
Поскольку агарозная матрица все же содержит заряженные группы, что
порождает ощутимый перенос жидкости к катоду, предлагалось постоянно
осушать поверхность геля у катода с помощью тонкой фильтровальной бумаги
(Thymann,
1980) или проводить ИЭФ при
Рис. 3.8. А. Приготовление слоя агарозного геля толщиной 1 мм и более.
Соот-
ветствующее количество раствора выливают прямо на расположенную
горизонтально пленку типа Gelbond (лучше пользоваться не шприцем, а
колбой Эрленмейера). В. Форма для заливки агарозных гелей толщиной менее
1 мм. Форму, на одну из поверхностей которой накладывают пленку Gelbond,
следует предварительно прогреть примерно до 50 °С. (Оба рисунка
