Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
при 4|0С в течение нескольких месяцев. Обработанные стекла следует
держать отдельно от обычных стекол, поскольку силанольное покрытие
сохраняет свою активность даже на протяжении нескольких циклов
полимеризации и не исчезает при мытье стекол. Поэтому если по ошибке гель
окажется заполимеризован между двумя обработанными стеклами, то при
разборке формы он просто порвется на две части.
Еще один вариант приготовления ультратонких гелей описан в работе
Ansorge, De Mayer, 1980. Используя метод скольжения, авторам удавалось
получать достаточно большие пластины
Глава 3
Рис. 3.18. Приготовление ультратонких гелей методом "скольжения". А -
принцип действия. 1 - прокладки, 2 - рабочий раствор, 3 - стеклянная
пластина (или термостатируемая подложка), 4 - зазор (~2 мм), 5 -
гребенка,
6 - верхняя стеклянная пластина (с вырезом для контакта с электролитом),
7 - вспомогательный блок. Б. Устройство системы. 8 - мотор, 9 -
вспомогательная пластина, 10 - вал, 11-горизонтальная основа, 12 -
направляющие
выступы, 13 -зажимы. (Ansorge, De Mayer, 1980.)
геля (до 60 см) толщиной от 100 до 300 мкм. Устройство и функционирование
этой системы проиллюстрировано на рис. 3.18. Между направляющими
выступами, расположенными по бокам горизонтальной основы, помещают
пластину, которая служит подложкой для геля. Рядом с этой пластиной на
небольшом расстоянии кладут еще одну, вспомогательную пластину такой же
толщины. По краям обеих пластин устанавливают тонкие тефлоновые
прокладки, поверх которых накладывают третью, верхнюю, пластину. Вначале
ее размещают таким образом, чтобы она покрывала в основном
вспомогательную пластину и лишь на несколько миллиметров заходила на
рабочую пластину. Благодаря системе направляющих выступов верхняя
пластина может скользить по прокладкам только в одном измерении. При
медленном скольжении верхней пластины удается равномерно распределить
рабочий раствор в виде сплошного слоя между нижней (рабочей) и верхней
пластинами. После окончания заполнения формы пластины можно плотно
прижать друг к другу с помощью зажимов.
Использование ультратонких гелей представляет собой одно из важнейших
нововведений в технологии ИЭФ, которое, воз-
Аналитическое ИЭФ
207
можно, вытеснит прочие традиционные методы аналитического ИЭФ. По-
видимому, особенно перспективно применение гелей этого типа для
двумерного фракционирования, причем не только на стадии ИЭФ, но и на
стадии ДДС-1\Га-электрофореза (Gorg et al., 1980b, 1981).
\
3^.14. Внесение образца при ИЭФ в плоских и цилиндрических гелях
При работе с обычными горизонтальными пластинами геля для внесения
образцов можно использовать самые разные способы; подходят шаблоны любого
типа, будь то лунки или рамочки, не позволяющие раствору образца
растекаться по поверхности геля. В готовой пластине ПААГ фирмы LKB
предусмотрено одновременное фокусирование 20 образцов в треках шириной 1
см. Для внесения образцов удобно пользоваться небольшими лунками, однако
можно наносить их и непосредственно на поверхность геля просто в виде
капель раствора или с помощью кусочков подходящего носителя, смоченных
раствором образца. Некоторые способы внесения образцов показаны на рис.
3.19. Правильный выбор материала цосителя имеет боль-
Рис. 3.19. Различные способы нанесения белкового раствора на гель для
ИЭФ, Снизу вверх: квадратик фильтровальной бумаги, смоченный раствором
образца; прямоугольный кусочек бумаги; два квадратных кусочка,
расположенных вблизи каждого из электродов; лунка, вырезанная в геле;
небольшой резервуар на поверхности геля; капля на поверхности; капля,
размазанная по поверхности в форме квадрата; полоска раствора на
поверхности; две капли, расположенные вблизи каждого из электродов.
(Vesterberg, 1973с.)
208
Глава 3
шое значение. Так, отмечалось, что многие белки с трудом переходят в гель
с широко используемых для нанесения образцов кусочков фильтровальной
бумаги (Waldstrom, Smyth, 1975а). В этом случае лучше пользоваться
ацетилцеллюлозой или выг сушенным полиакриламидом.
Растворы с неизвестной концентрацией образца можно наносить с помощью
кусочков фильтровальной бумаги, вырезанных в форме остроугольного
треугольника. Сфокусированные зоны будут выглядеть как длинные тонкие
полосы с линейно нарастающей интенсивностью, по которым можно оценить
величину оптимальной загрузки данного образца для последующих
экспериментов. Сильно разбавленные образцы можно наносить с помощью
длинных прямоугольных полосок бумаги или подходящего размера желобков в
геле. С помощью желобка можно нанести до 150 мкл раствора, в который при
этом следует добавить амфолиты в такой же концентрации, что и в геле, для
того, чтобы избежать локального искажения градиента pH. Ввиду того что
полоски различных носителей могут неконтролируемо адсорбировать
непредсказуемое количество образца, сейчас для нанесения предпочитают
пользоваться специальными лентами из силиконовой резины с прорезанными в
