Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
вой сумки, пересаженного от зародыша одного вида зародышу другого. В подобных экспериментах было обнаружено, что клетки, остающиеся в мезенхиме сумки, подвергаются гра-нулоцитарной дифференцировке, в то время как клетки, вступающие в контакт с эпителием, дифференцируются в лимфоциты (Houssaint et al., 1976). На зародышевых стадиях онтогенеза млекопитающих В-клетки образуются как в печени, так и в селезенке и в костном мозге (Nossal, Pike, 1973; Kamps, Cooper, 1982), но вскоре после рождения выработка В-клеток ограничивается только костным мозгом (Osmond, Everett, 1964; Osmond, 1975; Landreth et al., 1981). К тому же в костном мозге ранние предшественники В-клеток локализуются преимущественно в субэндостинальной области и, по-видимому, дают начало дифференцированным потомкам, продвигающимся по направлению к гемопоэтическим тканям, лежащим около центрального венозного синуса (Osmond et al., 1981).
Наконец, было показано, что для созревания in vitro предшественников В-клеток из печени плода или из костного мозга новорожденных и взрослых животных требуются прикрепляющиеся к подложке вспомогательные клетки (Kincade et al., 1981; Paige, 1983; Jyonouchi, Kincade, 1983; Paige et al., 1984).
Описанная ниже культуральная система была разработана в целях идентификации клеточных популяций, необходимых для обеспечения дифферёнцировки В-клеток in vitro.
II. ПРИНЦИП МЕТОДА
Ранее уже были разработаны методы длительного культивирования клеток костного мозга. Эти методы обеспечивают непрерывный рост гемопоэтических предшественников и в зависимости от используемых условий культивирования позволяют получать гранулоциты и эритроциты (Dexter, Lajtha, 1974; Dexter, Testa, 1980) либо пре-В- или зрелые В-клетки (Whitlock, Witte, 1982; Whitlock et al., 1984). Вместо культуральных систем, которые инициируются смесью неразделенных клеток, мы используем другие системы и применяем двухстадийную процедуру. На первой стадии мы получаем популяцию прикрепленных к подложке клеток стромы костного мозга мышей C.AL 20, а на второй добавляем к ним предшественники из костного мозга взрослых мышей BALB/c, очищенные от зрелых В-клеток и от вспомогательных клеток. За образованием функциональных В-клеток в этих дифференцирующихся культурах следят, отбирая аликвоты неприкрепленных клеток и стимулируя их липополисахаридом (ЛПС) в микрокультурах с помощью метода лимитирующих разведений. Антитело-секре-
Создание клеточного микроокружения
243
тирующие клетки, происходящие от клеток BALB/c, появляются в atpx микрокультурах через 4 дня. Их определяют с помощью обратного локального гемолиза, используя моноклональные антитела, специфичные к Ig-аллотипу BALB/c.
III. МАТЕРИАЛЫ
А. Мыши
В качестве доноров клеток костного мозга используют 4 —
5-недельных самок мышей BALB/c (Институт медико-биологических исследований, Фюлинсдорф, Швейцария) или C.AL20 (разводка Базельского института иммунологии). Здоровых животных содержат в разгороженных клетках.
Для получения клеток тимуса, предназначенных для стимуляции В-клеток в микрокультурах, используют самок крыс Lewis не старше пяти недель.
Б. Солевые растворы и среды
Сбалансированный солевой раствор (СР, pH 7,2) содержит
0,14 г СаС12-2Н20, 0,4 г КС1, 0,06 г КН2Р04, 0,2 г MgCl2-6H20,
0,2 г MgS04-7H20, 8,0 г NaCl, 0,35 г NaHCOs, 0,24 г Na2HP04-¦2Н20, 1 г глюкозы и 0,01 г фенолового красного на 1 л дистиллированной воды.
В состав забуференного фосфатами раствора хлористого натрия (ЗФР, pH 7,2), не содержащего Са и Mg, входят: 8 г NaCl, 2,88 г Na2HP04-12Н20, 0,2 г КН2Р04 и 0,2 г КС1 на 1 л дистиллированной воды.
Среду RPMI 1640 поставляет фирма Gibco. В эту среду добавляют 5% СПК (Gibco), 2-МЭ до концентрации 5-10—5 М и антибиотики: 5000 ед. пенициллина и 5000 мкг/100 мл среды стрептомицина. Отбирают те партии СПК (инактивированной нагреванием при 56 °С в течение 30 мин), которые не увеличивают числа «фоновых» клеток, появляющихся в культурах селезенки в отсутствие антигена и секретирующих антитела к эритроцитам барана. Другим критерием отбора служит способность сыворотки стимулировать рост В-клеток.
Модифицированную Исковом среду Дульбекко (МСИДИ) готовят в тот же день из среды Дульбекко (МСИД; Gibco 074—2100, Gibco Europe Paisley, Scotland). Для приготовления 100 мл полной среды к 41 мл двукратно концентрированной МСИД добавляют 3,3 мл NaHC03 (7,5%), 1 мл ГЭПЭС-буфера (1М; Gibco), 10 мг стрептомицина, 5-104 ед. пенициллина, 0,1 мл
2-МЭ (5-10-2 М), 0,8 мл смеси витаминов и аминокислот, со-
16'
244 Глава 14
стоящей из 2,5 мг/мл L-аланина, 2,5 мг/мл L-аспарагина, 3 мг/мл L-аспарагиновой кислоты, 7,5 мг/мл L-глутдминовой кислоты, 4 мг/мл L-пролина и 11 мг/мл пирувата натрия [все ингредиенты растворяют при перемешивании в 96 мл дистиллированной воды при 40 °С и затем к ним добавляют 0,64 мл витамина Bi2 и биотина (исходный раствор витаминов содержит 1 мг каждого из них в 4 мл 1 мМ HCI)], 0,4 мл L-цистина (исходный раствор содержит 7 мг/мл в 0,25 М НС1), 250 мкл обезжиренного БСА (Behringwerke A. G., Marburg a. d Lahn, ФРГ; исходный раствор содержит 200 мг БСА в 1 мл дистиллированной воды), 0,5 мл соевого лецитина [Nattermann, Cie, Cologne, ФРГ; обработанная ультразвуком смесь содержит 200 мг липида, 10 мкл токоферола (Sigma), 2,5 мл обезжиренного раствора БСА и 47,5 мл среды Дульбекко], 10 мкл человеческого трансферрина [Behringwerke A. G.; исходный раствор содержит 1 г трансферрина в 10 мл забуференной ГЭПЭС (10 мМ) среды Дульбекко с добавлением 0,84 мл раствора FeCl3 (7,4-10-9 М Fe3+ на 1 мг трансферрина, растворенного в 0,1 мМ НС1)] и дистиллированную воду до 100 мл. Подробное описание приготовления и условий хранения этой среды см. в работах (Iscove, Melchers, 1978; Iscove, 1984).
