Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
При использовании фиколла (Pharmacia Fine Chemicals) клетки в 5 мл СР наносят на его слой объемом 3—5 мл и центрифугируют при 1400 g в течение 20 мин при комнатной температуре. Клетки, локализованные в интерфазе, отбирают и промывают 3 раза в СР.
д. В-клетки активируют, используя митогены или антитела к иммуноглобулинам. Липополисахарид (ЛПС; Difco, источник Escherichia coli 055: В5,очистка по Вестфалю) используют в конечной концентрации 50 мкг/мл. Хотя мы обычно титруем все партии ЛПС для определения его оптимальной митогенной дозы, практически во всех случаях наилучшая стимуляция име-
236 Глава 13
ла место при концентрации ЛПС 50 мкг/мл. Для стимуляции с помощью антител к иммуноглобулинам мы обычно использовали связанные с сефарозой моноклональные антитела против Ig АК 13, которые описал Лептин (Leptin, 1983). Связывание с активированной BrCN сефарозой проводили в соответствии с процедурой, рекомендованной в руководстве «Аффинная хроматография: принципы и методы», изданном фирмой Pharmacia Fine Chemicals. Использовали примерно 1 мг антител на 1 мл набухшего геля. Наилучшие результаты получены с очищенными антителами, однако можно использовать и фракцию, осаждаемую при 50%-ном насыщении сульфатом аммония культуральной жидкости гибридом. В этом случае следует удвоить количество связываемого с сефарозой белка.
III. УСЛОВИЯ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АКТИВАЦИИ
Мы и другие исследователи убедились, что необходимым условием для хорошего пролиферативного ответа на действие растворимых факторов является предварительная активация клеток. Есть два основных подхода для достижения предварительной активации. При первом подходе (Howard et al., 1982) используют методику совместной стимуляции, согласно которой митоген постоянно присутствует в среде в концентрации ниже оптимальной и пролиферативный ответ наблюдается, только если к культурам добавляют поддерживающие рост лимфокины. Альтернативный метод, описываемый ниже, состоит в том, что клетки предварительно активируют митогеном, отмывают от несвязавшегося митогена и затем вновь культивируют в среде, содержащей лимфокины (Lernhardt et al., 1982; Leanderson et al., 1982).
Эффект тестирования во многом зависит от исходной клеточной популяции. Идеальной является гомогенная популяция покоящихся В-клеток. После обработки спленоцитов антителами против Т-клеток и комплементом с последующим фракционированием в градиенте плотности перколла и выделением клеток, собирающихся в интерфазе между плотностями 1,080 и 1,085, получают фракцию, содержащую более 90% клеток с поверхностными иммуноглобулинами (М. Julius, личное сообщение).
Обычно используют популяции клеток, полученные описанным способом из селезенок мышей линий СЗН или C57BL/6; для разных линий животных не было замечено никаких различий. Другой вариант, в котором используются клетки селезенки мышей пи/пи, мы не рекомендуем. Показано, что эти клеточные популяции дают очень высокий ответ на ИЛ-2 после преактива-ции. Остается неясным, отражает ли этот эффект прямое влияние ИЛ-2 на субпопуляцию В-клеток селезенки мышей nude.
Тесть\ для выявления лимфокинов_____________________________237
Стимуляция ИЛ-2 включения тимидина в популяции таких «В»-клеток может объясняться присутствием в них примесей Т- или \пре-Т»-клеток. В связи с этим следует отметить, что популяций В-клеток, приготовленные в соответствии с описанной выше процедурой, не отвечают на действие ИЛ-2. С практической точки зрения во всех случаях важно ставить пробы на присутствие Т-клеток в В-клеточных популяциях с использованием чувствительности к Кон-А в качестве негативного контроля.
Методика предварительной активации предусматривает использование высоких концентрации клеток (5-10® клеток/мл), что обеспечивает высокий выход живых бластных форм и достаточную экономичность процедур. Мы преактивируем клетки антителами против IgM в течение 40—48 ч, в то время как при активации ЛПС бласты накапливаются обычно через 20—24 ч. Если необходимо активировать клетки ЛПС в течение 48 ч, то для хороших выходов жизнеспособных бластов рекомендуется снизить концентрацию обрабатываемых клеток в пять раз.
Методика предварительной активации:
1. Трех мышей линии C57BL/6 забивают цервикальной дислокацией и стерильно извлекают из них селезенки.
2. Селезенки измельчают до получения суспензии, содержащей отдельные клетки, и дают возможность крупным фрагментам ткани осесть на дно пробирки.
3. Осадок и супернатант собирают.
4. Клетки ресуспендируют до концентрации 3-107 клеток/мл в СР и добавляют анти-ТЙу-антитела в соответствующем разведении.
5. Смесь инкубируют при комнатной температуре 20— 30 мин.
6. Клетки осаждают и супернатант убирают пипеткой.
7. Клетки ресуспендируют в комплементе (в соответствующем разведении) и инкубируют в течение 30—40 мин при 37 °С с периодическим перемешиванием.
8. Клетки осаждают и супернатант удаляют. Клеточный осадок суспендируют в 5 мл СР, наслаивают его на градиент перколла (как описано в разд. II) и центрифугируют 30 мин при 1400 g.
