Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 93

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 87 88 89 90 91 92 < 93 > 94 95 96 97 98 99 .. 239 >> Следующая

При культивировании прикрепляющихся клеток костного мозга к МСИДИ добавляют 5% СПК (Gibco), а стимуляцию В-клеток ЛПС в микрокультурах проводят в бессывороточной МСИДИ.
В. Микроносители для прикрепляющихся клеток
Микроносители Cytodex 1 получают от фирмы Pharmacia Fine Chemicals (Uppsala, Швеция). Их основу составляет поперечно-сшитый декстран, несущий положительно заряженные М,М-диэтиламиноэтильные (ДЭАЭ) группы.
Г. Сефадекс G-10
Сухие гранулы сефадекса G-10 (Pharmacia) добавляют к объему ЗФР, в 3—4 раза превышающему объем гранул в набухшем состоянии. Суспензию оставляют на 12 ч при комнатной температуре и затем трижды промывают гранулы тем же объемом ЗФР. Гранулы ресуспендируют в объеме ЗФР, который в 1,3 раза превосходит их собственный объем, отбирают аликвоты по 20 мл в пластиковые пробирки и автоклавируют их 20 мин при 115°С и 1 атм. Пробирки можно хранить несколько месяцев при 4°С.
Создание клеточного микроокружения
245
Д. Пластиковая культуральная посуда
Созревающие культуры выращивают в 6-луночных панелях Costar № 3506 (Costar, Cambrige, МА; площадь поверхности 10,2 см2).
Стимуляцию В-клеток липополисахаридом проводят в плоскодонных лунках панелей для микротитрования (Costar, № 3596; 96 лунок). Для приготовления клеток костного мозга, очищенных от В-клеток, используют покрытые антителами пластиковые чашки Петри (100x15 мм) (Falcon, Oxnard, СА).
IV. ПРОВЕДЕНИЕ ОПЫТОВ
А. Сбор клеток костного мозга мыши
Как при получении культур прикрепляющихся клеток, так и при приготовлении суспензий, лишенных мышиных зрелых В-клеток, собирают клетки костного мозга и манипулируют с ними одинаково. Все процедуры проводят в ламинаре в стерильных условиях. Мышей забивают с помощью асфиксии в С02 и немедленно споласкивают в 70%-ном этаноле. Удаляют кожу с задней части животного, в том числе с обеих задних лап. Для того чтобы отделить бедренную кость от мышечной ткани, через бедренную мышцу проталкивают два широких пинцета (Aesculap BD45, Fa. Riegger, Базель, Швейцария) так, чтобы бранши пинцетов обхватили бедренную кость. Затем пинцеты осторожно двигают вверх и вниз на полную длину кости, отделяя от нее мышцы. После этого пинцеты поворачивают, разрушая сочленение между бедренной и большеберцовой костью, а бедренную кость вытягивают наружу и очищают от ткани. Обнаженную бедренную кость разрезают чуть ниже прикрепления к тазу и переносят в чашку Петри, содержащую охлажденный во льду СР. Затем ее берут стерильным пинцетом за середину и содержимое костномозговой полости тщательно вымывают 2 мл СР, используя шприц на 2 мл с иглой № 25. Для того чтобы удалить субэндостиальные стромальные клетки, внутреннюю поверхность кости скоблят иглой. Клетки собирают во льду, центрифугируют 10 мин при 200 g в центрифуге с охлаждением и ресуспендируют в МСИДИ с сывороткой. Число ядерных клеток определяют подсчетом в растворе Турка. Выход клеток из каждой бедренной кости составляет ~ 107.
Б. Создание микроокружения костномозговых клеток
В каждую лунку 6-луночной панели Costar вносят по 2-10® клеток костного мозга мышей С. AL20 в 2 мл МСИДИ, содержащей 5% СПК Это соответствует ~2-105 клеткам на 1 см2.
246 Глава 14
Культуры инкубируют в увлажненном термостате при 37 °С и 5% СОг. Мы обычно заворачиваем чашки в пластиковую пленку для предотвращения циркуляции воздуха, что существенно снижает вероятность контаминации микроорганизмами. Через 24 ч клетки ресуспендируют в лунках и неприкрепив-шиеся клетки удаляют полностью, заменяя культуральную среду на свежую. Истощенную среду вновь полностью заменяют на 5-й и 9-й день инкубации. Конфлюентный слой прикрепившихся клеток обычно получают через 10—12 дней культивирования. К этому времени культуральную среду заменяют 2 мл полной среды RPMI 1640, содержащей гидратированный микроноситель Cytodex 1 в концентрации 1 мг/мл. Оседая, гранулы микроносителя образуют правильный монослой. Инкубацию продолжают еще 4 дня, в течение которых клетки со дна лунок распространяются по поверхности микроносителя. Когда слой клеток на микросферах становится конфлюентным, культуры готовы к заселению предшественниками В-клеток.
В. Приготовление костномозговых предшественников В-клеток
Клетки мышей BALB/c вымывают из полости бедренной кости, как описано в разд. IV, А, а прикрепляющиеся клетки удаляют фильтрацией через гранулы сефадекса G-10 (Ly, Mis-hell, 1974).
В стерильный пластиковый шприц на 5 мл помещают небольшой кусочек влажной стеклянной ваты, на которую пипеткой осторожно наливают 5 мл суспендированного в воде сефадекса G-10. Колпачок, закрывающий выход из шприца, заменяют иглой № 18, после чего жидкость (ЗФР) свободно вытекает из шприца. Колонку промывают 30 мл полной среды RPMI 1640 (забуференной 20 мМ ГЭПЭС) и уравновешивают при комнатной температуре в течение ночи. На колонку наносят 1 мл суспензии, содержащей не более 108 клеток в забуференной ГЭПЭС полной среде RPMI 1640, и позволяют жидкости впитаться в слой сефадекса. После этого добавляют 1 мл среды, оставляют колонку при комнатной температуре на 10 мин и затем промывают ее 12 мл среды. Клетки элюата дважды промывают холодным СР (200 g, 10 мин, 4°С). Выход клеток варьирует от 40 до 60%.
Предыдущая << 1 .. 87 88 89 90 91 92 < 93 > 94 95 96 97 98 99 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed