Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Создание клеточного микроокружения
249
щие клетки от доноров С. AL20 могут быть обнаружены с помощью бараньих эритроцитов (БЭ), конъюгированных с белком A (Pharmacia) (Gronowicz et al., 1976). Для конъюгации БЭ с антителами 33.24 1 мл осажденных (700 g, 10 мин, 4°С) эритроцитов, которые были трижды промыты в 0,9%-ном NaCl, добавляют к смеси, состоящей из 8 мл 0,9%-ного NaCl, 1 мл аффинно-очищенных антител 33.24 (исходный раствор содержит 0,5 мг антител на 1 мл) и 50 мкл 0,05 М СгС13. Суспензию клеток инкубируют 1 ч при 30°С (несколько раз перемешивая) и перед использованием промывают один раз в 0,9%-ном NaCl и дважды в СР (700 g, 10 мин, 4°С). Смесь для формирования зон гемолиза состоит из равных объемов 20%-ной суспензии конъюгированных эритроцитов, кроличьей антисыворотки к |л,-цепям мыши, разбавленной в соотношении 1 : 20 СР и комплемента морской свинки (Behringwerke A. G.), абсорбированного бараньими эритроцитами и разбавленного в соотношении 1 : 4 СР. Для получения зон гемолиза панели центрифугируют (150g, 10 мин, 4°С) и культуральную среду стряхивают. Затем мультипипеткой Titertek в каждую лунку добавляют 50 мкл смеси, предназначенной для образования зон гемолиза. Содержимое (50 мкл) пяти лунок (один ряд) отбирают мультипипеткой и разливают в стеклянные пробирки на 5 мл, содержащие по 250 мкл теплого агара (5%-ный агар в СР при конечной концентрации ДЭАЭ-декстрана 0,05%; водяная баня 46 °С). Содержимое всех пяти пробирок быстро перемешивают на вортексе и заливают в пластиковые чашки Петри диаметром 10 см. На слой агара кладут круглые покровные стекла (диаметр 22 мм; Assistent, Glaswarenfabrik К. Hecht, 8595, Швейцария) и затем чашки инкубируют в увлажненном инкубаторе при 37 °С. Зоны гемолиза подсчитывают 4—5 ч спустя.
Популяция костномозговых клеток-предшественников, использованная в эксперименте, проиллюстрированном на рис. 14-1, содержала не более одной sIgM-секретирующей клетки на 50 000 клеток, а частота встречаемости клеток, чувствительных к ЛПС, в этой популяции была ниже 10-4. Культивирование таких клеток-предшественников на прикрепившихся клетках костного мозга приводит к возникновению двух пиков образования функционально зрелых В-клеток (рис. 14-1). Ранний пик с частотой встречаемости ЛПС-реактивных клеток, варьирующей от 1 : 20 до 1 : 30, появляется после 24—48 ч инкубации. Прикрепившиеся клетки костного мозга усиливают эту раннюю генерацию В-клеток, но она наблюдается и в их отсутствие. Второй пик В-клеточной дифференцировки с частотой встречаемости ЛПС-реактивных клеток от 1 : 50 до 1 : 100 наблюдают через 5—6 сут культивирования. Эта поздняя генерация зависит от присутствия слоя прикрепившихся клеток.
250 Глава 14
Время инкубации in vitro, сут
Рис. 14-1. Частота встречаемости ЛПС-реактивных В-клеток в созревающих культурах в зависимости от времени инкубации. Предшественники В-клеток культивировали в присутствии (кружки) или в отсутствие (треугольники) преформированного слоя прикрепляющихся клеток костного мозга.
Число клеток через 5 сут культивирования составляет 45—55% числа клеток исходной популяции. К десятым суткам оно составляло приблизительно 30%. Таким образом, флуктуации в частоте встречаемости зрелых В-клеток не отражают изменения общего числа клеток в культуре. Параллельно с увеличением функционально зрелых В-клеток растет число клеток, несущих поверхностный IgM, в то время как число пре-В-клеток, содержащих |л,-цепи в цитоплазме, снижается (неопубликованные данные). Частота встречаемости функционально зрелых В-клеток, зарегистрированная в этих культурах, хорошо согласуется с теми данными, которые получены при использовании свежих клеток костного мозга (Benner et al., 1981).
Способность вспомогательных клеток поддерживать созревание В-клеток in vitro зависит от конкретного клеточного состава используемых популяций. В пользу этого говорят наблюдения, согласно которым прикрепившиеся клетки костного мозга из «декстеровских» культур и прикрепляющиеся клетки тимуса не способны стимулировать дифференцировку В-клеток (Gisler et al., 1985).
Создание клеточного микроокружения
251
Время инкубации in vitro, сут
Рис. 14 2. Происхождение зрелых В-клеток в культурах, содержащих непри-крепляющиеся предшественники нз костного мозга н прикрепляющиеся клетки стромы костного мозга. Проанализировано 120 микрокультур, содержащих 1000 иеприкрепляющихся клеток, собранных из созревающих культур. По ординате — процент культур, которые после стимуляции ЛПС содержали по крайней мере 6 клеток, образующих зоны гемолиза. По абсциссе — время инкубации клеток-предшественников из костного мозга в созревающих культурах. Предшественники BALB/c, культивируемые на слое прикрепившихся клеток костного мозга C.AL20: кружки, пунктир — зоны гемолиза, выявляемые с помощью А-белка; кружки, сплошная линия — зоны гемолиза, выявляемые с помощью аллотип-специфических (BALB/c) антител Предшественники C.AL20, Культивируемые на слое прикрепившихся клеток BALB/c: треугольники, пунктир— зоиы гемолиза, выявляемые с помощью А-белка; треугольники, сплошная линия — зоны гемолиза, выявляемые с помощью аллотип-специфических (BALB/c) антител.
