Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 94

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 88 89 90 91 92 93 < 94 > 95 96 97 98 99 100 .. 239 >> Следующая

На следующих этапах зрелые В-клетки удаляют из суспензии неприкрепившихся клеток с помощью их последовательного связывания с антителами против ц-цепей и 1а-антигенов, сорбированных на пластиковых чашках Петри Optilux диаметром 100 мм. Подробности этой методики были описаны ранее (Wysocki, Sato, 1978). Для адсорбции клеток используют крысиные моноклональные антитела (против |л-цепей мыши:
Создание клеточного микроокружения
247
С-2-23; против Iad мыши: 14-4-4). Выбор именно этих антител определяется тем, что при иммобилизации на чашках Петри они не активируют В-клетки. Антитела разводят до концентрации 5 мкг/мл в трис-буфере (0,05 М трис-НС1, 0,15 М NaCl, pH 9,5). В каждую чашку наливают 10 мл раствора антител, осторожными вращениями чашки равномерно распределяют раствор по дну и инкубируют 40 мин при комнатной температуре. После этого раствор выливают, а поверхность чашек промывают 4 раза ЗФР и один раз ЗФР, содержащим 1% СПК инактивированной нагреванием (ЗФР — СПК). Наконец, в каждую чашку добавляют 3 мл ЗФР, содержащего 5% СПК и 5-10® клеток, и выдерживают 70 мин при 4°С, время от времени перемешивая. Осторожно вращая чашки, сливают всю жидкость, в которой находятся неприкрепившиеся клетки. В чашки добавляют 5 мл холодного ЗФР — СПК (5%), осторожными вращательными движениями смывают оставшиеся клетки и объединяют эту жидкость с первым объемом. Выход клеток на каждом этапе адсорбции варьирует от 30 до 50%. Собранные клетки используют как источник предшественников для получения культур зрелых В-клеток.
Г. Созревающие культуры
Созревающие культуры инициируют добавлением к культурам прикрепившихся клеток костного мозга 2 мл полной среды RPMI 1640, содержащей 2 -10® клеток-предшественников. Засевают по 6 чашек на каждую экспериментальную группу. Для определения количества функционально активных В-клеток регулярно в течение 14 дней из культур отбирают пробы неприкрепившихся клеток. Для этого неприкрепившиеся клетки суспендируют осторожным пипетированием, используя пластиковую пипетку на 1 мл, и отбирают объемы среды, увеличивающиеся в зависимости от возраста культуры (1-й и 2-й день:
0,2 мл; 4—6-й день: 0,3 мл; 8—10-й день: 0,5 мл; 11—14-й день: 1 мл). Для компенсации в культуры добавляют эквивалентный объем свежей полной среды. Пробы клеток из каждой экспериментальной группы объединяют и подсчитывают число ядерных клеток в растворе Турка.
Д. Определение функционально активных В-клеток
Появление функционально активных В-клеток в дифференцирующихся культурах прослеживают, стимулируя определенное число собранных неприкрепившихся клеток липополисаха-ридом (ЛПС; LPSW Escherichia coli 055 :В 5,Difco) в микрокультурах с применением метода лимитирующих разведений.
248 Глава 14
Через 4 дня в этих микрокультурах определяют частоту встречаемости клеток, секретирующих аллотип-специфические иммуноглобулины. Мы делаем это в условиях, описанных Андерс-соном и др. (Andersson et al., 1977). На первом этапе получают клетки тимуса крысы и вносят их в лунки панелей для микротитрования Costar. Для этого самок крыс Lewis (не старше 5 нед) забивают методом асфиксии в СОг- Стерильно удаляют у них тимус, отделяя последний от околотимусных лимфатических узлов, разрезают его на мелкие кусочки острыми ножницами и затем осторожно продавливают через стерильное ситечко, используя поршень шприца на 5 мл. Полученную клеточную суспензию дважды промывают СР (200 g, 10 мин, 4°С) и ресуспендируют приблизительно в 20 мл МСИДИ без сыворотки. Если слой клеток тимуса используют в тот же день, то МСИДИ должна содержать 50 мкг ЛПС на
1 мл. Вместе с тем можно приготовить этот слой за 3 дня до использования. В этом случае клетки инкубируют при 37 °С и 5% СОг в МСИДИ без ЛПС. Готовят суспензию, содержащую 6-10® клеток тимуса в 1 мл, и мультиканальной пипеткой (Titertek № 77-890-07; Flow Laboratories Irvine, Scotland) разливают по 100 мкл этой суспензии в каждую лунку панели для микротитрования. Таким образом, каждая лунка содержит
6-105 клеток. Периферические лунки не используют, так как из них быстро испаряется среда.
Частоту встречаемости функционально активных В-клеток в пробах, отобранных из созревающих культур, определяют методом лимитирующих разведений (Lefkovits, Waldmann,
1979). Количество клеток, вносимых в микрокультуры, должно перекрывать ожидаемое число зрелых В-клеток (день 0: 103— 104; дни 1, 2 и 5—7: 10—3-102; дни 3, 4 и 10—14: 30—3-103). Для тестирования каждой концентрации клеток заполняют 60 одинаковых лунок. Клеточную суспензию в МСИДИ, содержащей ЛПС, разливают по 100 мкл в каждую лунку (конечная концентрация ЛПС 10 мкг на лунку). Для этого используют мультипипетку Eppendorf № 4780 (позиция 2) с присоединенным к ней наконечником на 2,5 мл (Netheler, Hinz GmbH, Hamburg, ФРГ). Культуры инкубируют 4 сут при 37 °С и 5% С02.
Клетки, секретирующие иммуноглобулин, подсчитывают методом обратного локального гемолиза, используя бараньи эритроциты, покрытые крысиными моноклональными антителами 33.24 (Griitzmann, 1981). Эти антитела реагируют с IgM гапло-типа IgCHa мышей BALB/c (Molinaro et al., 1974), ноне распознают IgM гаплотипа IgCHe мышей СА. AL20. Таким образом, реакция выявляет В-клетки только из использованной нами популяции предшественников. Тем не менее IgM-секретирую-
Предыдущая << 1 .. 88 89 90 91 92 93 < 94 > 95 96 97 98 99 100 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed