Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
9. Клетки, локализованные в интерфазе между 74%-ным и 68%-ным перколлом, отбирают и отмывают их 3 раза СР с 5% СПК.
10. Определяют число клеток и разбавляют суспензию до концентрации 5-10® клеток/мл.
11. Добавляют ЛПС (50 мкг/мл) или препарат антител против IgM в соответствующей концентрации.
12. Лунки контрольной панели для микротитрования запол-
238 Глава 13
няют чистой средой, ЛПС (50 мкг/мл) и Кон-А в оптимальной концентрации. Добавляют покоящиеся клетки до конечной концентрации 5-105 клеток/мл. С помощью этого теста на пролиферацию можно оценить чистоту клеточной популяции, которая будет активирована при проведении основного эксперимента. Клетки обычно собирают на второй день после двухчасового импульсного мечения 3Н-тимидином. Ответ на Кон-А должен быть на уровне фона, в то время как ответ на ЛПС должен быть достаточно сильным. Усиление ответа на Кон-А свидетельствует о присутствии в популяции Т-клеток, в то время как позитивная реакция на ЛПС-стимуляцию характерна для В-кле-ток и мононуклеарных макрофагов.
IV. УСЛОВИЯ РЕКУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Активированные митогеном клетки выделяют при фракционировании в градиентах фиколла, поскольку этот процесс обеспечивает удовлетворительный выход нужных клеточных форм и не требует много времени. Если в процессе прекультивирова-ния использовали антитела против IgM, иммобилизованные на сефарозе, то соответствующую суспензию, содержащую клетки и сефарозу, следует перед нанесением на градиент фиколла интенсивно пипетировать для того, чтобы освободить клетки, связавшиеся с гранулами сефароз'ы. После фракционирования сефарозу можно использовать повторно минимум для трех циклов стимуляции, если промыть ее стерильной дистиллированной водой и перевести в соответствующий буферный раствор.
После разделения и отмывки клетки ресуспендируют в полной среде и хранят во льду; при концентрации >106 клеток/мл их можно хранить в течение 12 ч. Как уже упоминалось выше, не следует забывать о контроле на отсутствие Т-клеток. С этой целью кроме «провокационного» теста на Кон-А-активацию в каждом опыте проверяют реакцию преактивированных культур на действие ИЛ-2. Для этого используют или биосинтетический продукт клонированного гена человека, или препарат ИЛ-2, не обладающий стимулирующей рост активностью в отношении популяции В-клеток. Для проверки пролиферативной способности клеток всегда проводят тест с ЛПС.
Методика рекультивирования:
1. Клеточную суспензию интенсивно пипетируют для того, чтобы разбить клеточные агрегаты и отделить клетки от гранул сефарозы.
2. Клетки наносят на слой фиколла из расчета 5—10 мл суспензии на 5 мл фиколла.
3. Центрифугируют при 1400 g при комнатной температуре в течение 20 мин.
Тестц для выявления лимфокинов__________________________239
4. (Собирают клетки на границе фаз фиколл — СР и отмывают их 3\раза СР с 5% СПК-
5. Ресуспендируют клетки в полной среде и подсчитывают общее число ядерных клеток. Предполагаемый выход составляет 20—50% исходного числа клеток. Клетки хранят во льду.
6. Клетки помещают в лунки плоскодонных панелей для микротитройания при конечной концентрации 7,5¦104 ядерных клеток в 1 мл.
V. ИЗМЕРЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПРОЛИФЕРАЦИИ
Обычно мы оцениваем пролиферативный ответ по включению тимидина. В каждую лунку вносят по 1 мкКи 3Н-тимидина (5 мКи/моль) и через 2—4 ч клетки собирают и готовят для измерения радиоактивности. При использовании для предварительной активации культур антител против IgM фон на второй день рекультивирования весьма низок, и при более длительных инкубациях клеток с меткой достигают лучшего соотношения сигнал/фон.
Важно отметить, что мы, как и многие другие исследователи, используем специальные системы для сбора клеток — так называемые харвестеры, в которых клетки лизируются, а задержанный фильтрами материал промывается водой. При этом мы получаем данные о включении тимидина в культуру, в то время как обычно при исследованиях пролиферации интерес представляет включение тимидина в ДНК. Эти величины не всегда совпадают, что легко продемонстрировать на ЛПС-активирован-ных культурах, когда (в особенности через небольшие промежутки времени после стимуляции) изменения внутриклеточного пула тимидина приводят к более высоким уровням включения тимидина в клетки, чем в ДНК. Следовательно, прежде чем делать определенные заключения в отношении пролиферации, необходимы дополнительные эксперименты. Наиболее прямой способ определения числа клеток — это их непосредственный подсчет в различных культурах. При использовании другого способа фильтры с нанесенным клеточным материалом обрабатывают ТХУ (для снижения неспецифического связывания) и, измеряя радиоактивность, получают точные данные о включении тимидина в ДНК.
Следует также учитывать возможность загрязнения данной популяции клеток клетками других типов. Обычно к пролиферации под действием растворимых факторов способна лишь небольшая часть клеток исследуемой популяции. Поэтому присутствие в ней даже незначительных примесей клеток других типов, способных делиться при избытке какого-либо фактора, может «обеспечить» весь измеренный в опыте эффект пролиферации. Проиллюстрируем это на примере 5000 чувствительных
