Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 98

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 92 93 94 95 96 97 < 98 > 99 100 101 102 103 104 .. 239 >> Следующая

А. Приготовление агара
Для растворения бактоагара (Difco) стеклянную бутылочку или колбу Эрленмейера, содержащую 50 мл трижды дистиллированной воды и 1,5 г агара, помещают в кипящую водяную баню. Агар расплавляется за 10—15 мин, после чего раствор можно поддерживать в горячем состоянии на едва кипящей бане в течение нескольких часов и повторно использовать в течение дня. При нагревании над открытым пламенем раствор агара можно приготовить быстрее, однако это следует делать осторожно, непрерывно вращая сосуд с раствором, чтобы агар расплавлялся полностью (доводить до кипения трижды), а потери материала из-за выкипания были минимальными. В обоих случаях рекомендуется использовать склянки с неплотно закрытыми крышками. Как показали Кинкейд и др. (Kincade et al., 1976), в агаре присутствуют митогены, необходимые для пролиферации В-клеток в полужидкой среде. Другие полужидкие среды на основе метилцеллюлозы или агарозы проявляют митогенный эффект только при добавлении к ним экстракта агара. Мы не нашли больших отличий в способности разных партий агара поддерживать рост колоний В-клеток или колоний, возникающих из предшественников В-клеток, но обнаружили зависящие от партии агара небольшие вариации в консистенции образующегося агарового геля. Это несущественно для выявления колоний с помощью стереомикроскопа, но
Дифференцировка предшественников В-клеток
257
может создавать большие неудобства при переносе агарового геля на предметное стекло — процедуре, необходимой в ходе анализа секреции антител колониями В-клеток (Paige, Skar-vall, 1982). Поскольку митогенные свойства агара определяются концентрацией полианионных полисахаридов, а консистенция геля зависит от содержания несульфатированной 3,6-анги-дро-галактозы, неудивительно, что эти параметры могут варьировать независимо. В нашей практике мы столкнулись с тем, что из четырех партий агара одна оказалась непригодной для опытов с переносом геля на предметные стекла.
Б. Приготовление среды
Наилучших и наиболее воспроизводимых результатов мы добились при использовании среды Дульбекко, модифицированной Исковом (МСИДИ) (Iscove, 1984), хотя может быть рекомендована также среда Мак-Койса 5А с описанными ранее добавками (Kincade, 1981а, b; Paige et al., 1982). Состав полной среды (100 мл) и процедура ее приготовления приведены ниже.
1. 41 мл среды МСИД двойной концентрации (2х)
а. Готовят еженедельно из порошка МСИД (Gibco № 074-2100), растворяя его в половине того три-дистиллята, который рекомендуется по прописи
б. Стерилизуют через фильтр Nalgene с диаметром пор
0,2 мкм и хранят при 4°С в темноте
2. 3,3 мл NaHC03 (7,5%)
3. 1 мл ГЭПЭС-буфера (1М)
а. 1 М раствор, поставляемый Gibco (N-043-563)
4. 1 мл раствора пенициллин/стрептомицин
а. 50 ед. пенициллина и 50 мкг стрептомицина на 1 мл
5. 0,1 мл 2-МЭ (исходный раствор 5-10~2 М)
6. 0,8 мл смеси аминокислот
а. В состав смеси входит L-аланин (2,5 мг/мл), L-ac-парагин (2,5 мг/мл), L-аспарагиновая кислота (3 мг/мл), L-глутаминовая кислота (5 мг/мл), L-пролин (4 мг/мл), пируват натрия (11 мг/мл),
0,16 мг витамина Bi2 и 0,16 мг биотина; два последних компонента растворяют в НС1
б. Аликвоты этой смеси можно хранить при —20 °С по крайней мере в течение 2 мес
7. 0,4 мл цистина
а. 2,8 мг/мл в 0,25 М НС1
б. Аликвоты можно хранить при —20°С по крайней мере 2 мес
8. 2,5 мл БСА (200 мг/мл)
17—1278
258 Глава 15
а. Поставляется фирмой Boehringer № 225092А ORHD 20/21
б. Важно очистить БСА от липидов и деионизовать его, как описано Исковом (Iscove, 1984)
в. Аликвоты можно хранить при 4°С по крайней мере
2 мес
г. Концентрация для агаровых культур в 10 раз выше той, которую используют в жидких культурах
9. 5—7,5 мл сыворотки плода коровы (СПК)
а. Активность сыворотки варьирует в зависимости от партии. СПК, не способная поддерживать клональный рост В-клеток, встречается редко. Тем не менее высокая эффективность клонирования была достигнута только с 50—60% тестированных партий
б. Мы проверяем различные партии СПК при конечной концентрации 5, 10 и 15% и затем титруем отобранные партии сыворотки для определения оптимального разведения
в. Аликвоты можно хранить в замороженном состоянии при —20 °С по крайней мере 6 мес
10. Объем приготовленной смеси доводят до 100 мл дистиллированной водой
После смешивания компонентов смесь фильтруют и используют в течение 24 ч.
В. Приготовление двухслойных культур
1. Нижний слой агара
Нижний слой агара состоит из полной культуральной среды, содержащей 0,3% агара. Для его получения 3%-ный агар разбавляют в 10 раз нагретой до 37 °С средой, перемешивают и разливают по 1 мл в чашки Петри (диаметр 35 мм) или культуральные чашки (Falcon 1008 или 3005). Если условия анализа требуют применения митогенов, кондиционированной среды или других растворимых компонентов, то мы часто добавляем их к нижнему слою агара. Добавки можно включать в состав агарсодержащей среды до гелеобразования; это удобно в тех случаях, когда требуется большое число культур с одинаковым нижним слоем агара. Поскольку при внесении добавок концентрация агара уменьшается, следует либо вносить их в малом объеме (т. е. в концентрированном виде), либо уменьшать количество воды при приготовлении среды в соответствии с добавляемым объемом. Обычно мы игнорируем уменьшение концентрации агара, если добавленный объем составляет меньше 5% общего объема. Когда для опыта требу-
Предыдущая << 1 .. 92 93 94 95 96 97 < 98 > 99 100 101 102 103 104 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed