Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
90
85
_
Диэтиловый эфир (ґкип 36-37 °С)
15
20
18
10
—
30
Гексан
—
—
70
Ацетон
—
15
—
Уксусная кислота ледя-
I
1
1
1
—
2
ная
После того как хроматографическая камера насытится парами подвижной системы (10—20 мин), в нее вносят пластинку с нанесенными липидами, которую ставят вертикально или с небольшим наклоном (около 60°) к стенке камеры. В прямоугольную камеру ставят 2 пластинки в виде буквы V. Камеру быстро закрывают и оставляют при комнатной или пониженной температуре на 40—45 мин. Как только граница подвижной фазы достигнет линии, расположенной на 1 см ниже верхнего края (финиша), пластинку быстро извлекают и в горизонтальном положении подсушивают 10—15 мин под вытяжным шкафом.
Для проявления липидов отдельных классов пластинки спрыскивают из пульверизатора водным раствором серной кислоты или спиртовым раствором фосфоромолибденовой кислоты и прогревают в сушильном шкафу при 180—200 °С до обугливания. Липиды разных классов выступают в виде черных пятен. В этих случаях липиды отдельных классов (кроме фосфолипидов) разрушаются. Чтобы обнаружить липиды без разрушения, чаще используют пары йода. Несколько кристалликов йода насыпают в стеклянный бюкс, вносят несколько капель спирта и помещают в эксикатор. После того как произойдет некоторая возгонка йода, в эксикатор вносят
152
пластинку силикагелем вниз и крышку плотно закрывают. Через 10—15 мин липиды выступают в виде ярко-желтых или коричневых пятен. Пластинку вынимают, пятна отводят иглой и после испарения йода (под вытяжным шкафом) их соскабливают и переносят в пробирки для количественного определения.
Анализ классов липидов можно проводить без экстракции растворителем в присутствии силикагеля, используя вышеизложенные химические методы исследования. Но перед определением оптической плотности содержимое пробирок центрифугируют для осаждения силикагеля. При необходимости экстрагировать липиды от силикагеля используют метанол для фосфолипидов и хлороформ для ацилглицеринов, НЭЖК и холестерина.
При использовании подвижных фаз 1 и 3 классы липидов располагаются в одной, а при использовании фазы 5 — несколько в другой последовательности (табл. 25).
25. Значение Rf для отдельных лнпидных классов прн нспользованнн разных недвижных фаз
Фазы 1 и 3
Фаза 5
Класс липидов
Липиды
Липиды
Липиды
сыворотки крови
печени
сыворотки крови
Фосфолипиды 0,00
Моноацклглицерины 0,04
Диацилглицерины 0,08
Холестерин свободный 0,11
НЭЖК 0,20
Триацилглицерины 0,44
Холестерин этерифициро- Q 7д
ванный '
Для детектирования липидов отдельных классов на хроматогра-фической пластинке в качестве свидетелей используют чистые препараты отдельных липидов. При отсутствии свидетелей можно пользоваться коэффициентом подвижности отдельных классов — Rf. Для его расчета замеряют общую длину разгонки на пластинке (от нижней до верхней границы), которую принимают за 100 %, а затем замеряют местоположение отдельных классов (по центру пятна), рассчитывают их прохождение в процентах относительно всей длины разгонки и сравнивают с литературными данными. На всех подвижных фазах фосфолипиды остаются на старте (на месте нанесения), а самым верхним классом являются эфиры холестерина.
Для разделения фосфолипидов на подклассы используют то же оборудование и тот же принцип приготовления тонкого слоя, как описано выше, но слой должен быть толще — 400—500 мкм. Это связано с тем, что для количественного определения индивидуаль-
0,00
0,08 0,12 0,23 0,42
0,70
0,00 0,02 0,40 0,21 0,07 0,63
0,81
153
ных фосфолипидов по фосфору необходимо наносить на пластину несколько больше липидов (5—10 мг).
В качестве подвижной фазы для разделения фосфолипидов методом одномерной хроматографии чаще всего используют подвижные системы, состав которых представлен в таблице 25а.
Концентрированный раствор липидов (5—10 %) наносят на пластину в виде полосы шириной 1,5—2 см или более. Разгон фосфолипидов занимает около 1 ч. После подсушивания пластины проводят детектирование и идентификацию отдельных подклассов фосфолипидов в парах йода или путем опрыскивания его 10%-ным раствором серной кислоты с последующим прогреванием в сушильном шкафу. Обугливание органической части молекулы отдельных фосфолипидов не влияет на количественное определение фосфора, выполняемое химическим путем.
Состав подвижных систем:
хлороформ-метанол-вода, 65 : 25 : 4;
хлороформ-метанол-32,5%-ный раствор аммиака, 70 : 30 : 5; хлороформ-метанол-вода, 70 : 30 : 5.
Идентификацию индивидуальных фосфолипидов проводят с помощью свидетелей или по величине Rf в сопоставлении с литературными данными (табл. 25а).
25а. Значение величины Rf для фосфолипидов нри разделении их в разных системах
Подклассы
Подвижные системы
I
2
Фосфатидиловая кислота
0,87
_
—
Цереброзиды
—
0,64 (0,55)
0,79
Кардиолипин
0,77
0,55
