Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
При разделении жирных кислот на полярных жидких фазах сначала выходят насыщенные, затем ненасыщенные, а на неполярных фазах, наоборот, сначала выходят ненасыщенные, а затем насыщенные жирные кислоты.
Время от момента введения пробы в колонку до момента выхода той или иной кислоты называется временем относительного удерживания. Установлено, что время относительного удерживания очередной кислоты по сравнению с предыдущей увеличивается на величину, равную 1,56. Величины времени удерживания используются для идентификации пиков.
Некоторые жирные кислоты имеют близкое время относительного удерживания, однако у каждой из них только одно определенное время удерживания, не зависящее от присутствия других компонентов.
При соблюдении режима работы хроматографа (температура и скорость потока газов) воспроизводимость времени удерживания может составлять 99—100 %.
Данные по относительному времени удерживания метиловых эфиров жирных кислот на полярной и неполярных фазах при разных температурах приведены в таблице 29. От полярности фазы в значительной степени зависит качество разделения анализируемых смесей жирных кислот.
29. Относительное время удерживания метиловых эфнров жирных кислот на полярной н неполярных фазах (по литературным данным)
Кислота
Код*
Относительное время удерживания
Полярная фаза
Неполярные фазы
полиэтиленгликоль-адипат(/= 180 "С)
полиэтиленгликоль-сукцинат (t = 200 "С)
апиезон L (/= 197 •C)
Каприловая
8 : 0
0,060
0,096
0,030
Пеларгоновая
9 : 0
0,082
0,136
0,047
Каприновая
10 : 0
0,134
0,181
0,073
Ундекановая
11 : 0
0,183
0,237
0,117
Лауриновая
12 : 0
0,261
0,322
0,180
И*
163
Продолжение
Кислота
Код*
Относительное время удерживания
Полярная фаза
Неполярные фазы
полиэтиленгликоль-адипат (t = 180 *С)
полиэтиленгликоль-сукцинат (/ = 200 °С)
апиезон L (Г= 197 "С)
Тридекановая
13:0
0,362
0,412
0,250
изо
13:0
—
0,373
—
Миристиновая
14:0
0,510
0,565
0,420
изо
14:0
—
0,497
Миристолеиновая
14:1
0,600
—
Пентадекановая
15:0
0,705
0,704
0,66
изо
15:0
—
0,689
—
антеизо
15:0
—
0,689
0,68
Пальмитиновая
16:0
1,00
1,00
1,00
Пальмитолеиновая
16:1
1,15
0,90
Гептадекановая
17:0
1,40
L 29
1,51
Гептадеценовая
17:1
1,62
—
1,31
Стеариновая
18:0
1,97
1,75
2,36
Олеиновая
18:1
2,20
2,00
2,03
Линолевая
18:2
2,65
2,45
—
Линоленовая
18:3
3,25
3,16
—
Нондекановая
19:0
2,90
2,27
—
Арахиновая
20:0
3,87
3,11
5,80
Эйкозаеновая
20:1
4,44
—
—
Эйкозадиеновая
20:2
4,81
—
—
Эйкозатриеновая
20:3
5,30
—
3,65
Арахидоновая
20:4
6,56
5,44
3,48
Бегеновая
22:0
7,90
—
—
* Первые цифры означают количество атомов углерода в цепи, 0 — отсутствие двойных связей, 1, 2, 3 и 4 — количество двойных связей в молекуле жирной кислоты.
Для разделения метиловых эфиров жирных кислот, полярных соединений (фосфолипидов, свободных жирных кислот, холестерина, сфингомиелинов, а также жирных кислот общих липидов) обычно используют полярные фазы, а для разделения неполярных соединений (триацилглицеринов) — неполярные.
В зависимости от длины колонки, скорости потока газа-носителя и рабочей температуры время разделения смеси эфиров жирных кислот занимает от 40 до 60—70 мин. Чем короче колонка, выше температура и скорость потока газа-носителя, тем меньше время анализа. Однако при уменьшении длины колонки и повышении скорости газа-носителя разделение отдельных жирных кислот резко ухудшается. Поэтому длина колонки, скорость потока газа и температура должны быть оптимальными, что определяется качеством разделения. Чаще всего используют колонки длиной 1,5—2,5 м.
164
Идентификацию пиков жирных кислот на хроматограммах лучше всего проводить по стандартным смесям химически чистых метиловых эфиров жирных кислот. При этом следует начинать запись с простых смесей, содержащих 2—3, а затем 4—5 и больше жирных кислот, увеличивая их набор до максимума.
При отсутствии набора метиловых эфиров жирных кислот идентификацию проводят с помощью относительного времени удерживания отдельных жирных кислот, исходя из литературных данных (см. табл. 29).
Конечный результат разделения проб — определение абсолютного и относительного содержания в них отдельных жирных кислот. Оба эти расчета делают на основе установления площади того или другого пика, а также суммы площадей всех пиков. Поэтому правильное определение площади пика крайне важно. Существует несколько способов их вычисления на хроматограмме: 1) умножением высоты пика на ширину на половине его высоты (в мм); 2) вырезанием пиков и взвешиванием их (бумаги) на аналитических весах; 3) путем умножения высоты пика (мм) на относительное время удерживания кислоты в колонке хроматографа.
Наиболее признанным стал последний способ. За высоту пика с округлой вершиной берут точку пересечения двух линий, проведенных от базисной линии касательно боковых сторон пика. Полученную высоту (мм) умножают на время удерживания данного пика, которое определяется по расстоянию (мм) от момента введения пробы (первая реакция самописца) до центра (или верхушки) пика. Метод прост и дает точные результаты. Затем рассчитанные площади пиков суммируют (100 %) и рассчитывают долю (%) каждого пика (кислоты). При этом следует внести поправку на чувствительность детектора.
