Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кондрахин И.П. -> "Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики" -> 67

Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.

Кондрахин И.П., Архипов А.В., Левченко В.И., Таланов Г.А., Фролова Л.А., Новиков В.Э. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики: Справочник. Под редакцией Сайтаниди В.Н. — М.: Колос, 2004. — 520 c.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка): metodvetkllabdia2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 61 62 63 64 65 66 < 67 > 68 69 70 71 72 73 .. 246 >> Следующая

Ход определения. 0,1мл сыворотки (плазмы) вносят в колбочку, заливают экстрагирующей смесью и тщательно перемешивают. Через 2—3 мин содержимое пропускают через обезжиренный бумажный фильтр в мерную колбочку, доводят объем экстрагирующей смесью до 10 мл. В делительную воронку на 25 мл вносят 8 мл дистиллированной воды и 8 мл фильтрата (что соответствует 0,08 мл сыворотки). Содержимое хорошо перемешивают, отстаивают и нижний слой пропускают через стеклянную колонку размером 0,8 X 16 см (для задержки фосфолипидов), приготовленную следующим путем: в центрифужную пробирку со спиленным дном помещают кусочек стеклянной ваты и 0,5 г активированной кремовой кислоты. Перед использованием колонку промывают 5 мл хлороформа. Фильтрат пробы собирают в мерную колбочку на 10 мл или пробирку с делениями. Колонку промывают хлороформом, который также собирают в колбочку. Объем доводят хлороформом до метки. Затем в 3 пробирки вносят по 3 мл фильтрата (что соответствует 0,024 мл сыворотки или плазмы) и после выпаривания растворителя в водяной бане в первые две пробирки добавляют по 0,5 мл спиртового раствора KOH (омыляемые пробы), а в третью — 0,5 мл спирта (неомыляемая проба). Пробирки инкубируют в водяной бане 15 мин при 60 °С. В конце инкубации в каждую из них добавляют по 0,5 мл 0,2 н. раствора серной кислоты, а затем по 0,1 мл 0,05 моль/л раствора метперйодата натрия (для окисления глицерина, освобожденного омылением).

Через 10 мин (точно!) окисление приостанавливают добавлением по 0,1 мл 0,5 моль/л раствора натрия арсенита. Через 5—7 мин, когда испарится осводившийся йод, пробирки извлекают из бани и в них добавляют по 0,8 мл воды и по 2 мл ацетил-ацетонового реактива. Содержимое тщательно перемешивают перевертыванием пробирки и инкубируют в водяной бане при 58 °С в течение 10 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и колориметрируют при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 0,5 см против контроля.

Степень поглощения омыляемой пробы минус степень поглощения неомыляемой пробы соответствует количеству триацилглицеринов, содержащихся в 0,24 мл исходного объема сыворотки (плазмы) крови. В используемом объеме сыворотки (плазмы) крови показания неомыляемых проб обычно очень малы и не имеют существенного значения.

Расчет ведут по формуле или калибровочному графику, который строят в пределах от 10 до 250 мкг/мл триацилглицеринов.

142

* ~ (E0n/Е„) Сст,

где X — количество триацилглицеринов, мкг%; E0n — экстинкция опытной пробы; Е„ — экстинкция стандартной пробы; Сст — концентрация триолеина в стандартном растворе, мг%.

Из основного раствора готовят серию рабочих калибровочных растворов (табл. 22).

22. Приготовление рабочих калибровочных растворов

№ пробирки

1

2 3 4 5

Стандартный раствор, мл

0,1 0,5 1,0 1,0 1,0

Хлороформ, мл

9,9 9,5 9,0 4,0 3,0

Концентрация триацилглицеринов, мкг/мл

10

50 100 200 250

В 5 опытных пробирок вносят по 1 мл каждого рабочего раствора и в шестую пробирку — 1 мл хлороформа для контроля на реактивы. Все пробирки помещают в кипящую баню на 10 мин для удаления хлороформа. Затем в них добавляют по 0,5 мл спиртового раствора калия гидроксида и процедуру продолжают, как описано выше. Примечания. 1. Для анализа лучше использовать плазму крови, полученную на холоде, так как при получении сыворотки происходит частичный гидролиз триацилглицеринов. 2. В качестве антикоагулянта применяют ЭДТА натриевой или калиевой соли (1 мг на 1 мл крови). Гепарин применять не следует, так как он активирует липопротеидную липазу, гидролизи-рующую триацилглицерины. Клиническое значение. Концентрация триацилглицеринов (нейтральных жиров) в сыворотке крови животных повышается при скармливании кормов, обогащенных жирами или богатых легкодоступными углеводами (картофель, зерно кукурузы, пшеницы и др.), активизирующих липогенез в печени (у моногас-тричных). Недостаток в рационах протеина и липотропных веществ (холина, метионина, треонина, селена, витамина Е, никотиновой кислоты и др.) также сопровождается нарастанием уровня нейтральных липидов в сыворотке крови животных. Увеличение концентрации триацилглицеринов отмечается при острых гепатитах, жировой дистрофии печени, нефрозах, диабете. Снижение их концентрации наблюдается при низком уровне кормления животных, усиленной молокоотдаче.

Нормативы содержания триацилглицеринов в сыворотке крови животных приведены в приложении 5. Источник: 6, 29.

143

Определение содержания неэтерифицированных жирных кислот (НЭЖК) в сыворотке (плазме) крови (по Лауреллу и Тибблингу).

Принцип. Метод основан на образовании комплексных соединений НЭЖК с медью, которые с дифенилкарбазидом дают розово-малиновую окраску. По сравнению с другими он более чувствителен.

Реактивы: экстрагирующая смесь (ЭС) хлороформ-гептан 4 : 3 (по объему), содержащая 2 % метанола;

кремниевая кислота порошкообразная, предварительно активированная при 120 °С 12 ч;

меднотриэтаноламиновый реактив (Cu-ТЭА). 10 мл 0,5 моль/л раствора меди нитрата [Cu(N03)2]: 10 мл 1 моль/л триэтаноламина (ТЭА) и 3,5 мл 1 моль/л натрия гидроксида растворяют в воде и доводят объем до 100 мл. В данном растворе растворяют 33 г NaCl, pH доводят до 8,1. Раствор готовят каждые 2 нед;
Предыдущая << 1 .. 61 62 63 64 65 66 < 67 > 68 69 70 71 72 73 .. 246 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed