Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
0,84
Фосфатидилэтаноламин
0,52
0,45
0,58
Фосфатидилинозитол
0,40
0,11
0,20
Фосфатидилхолин
0,27
0,36
0,33
Фосфатидилсерин
0,21
0,06
0,10
Сфингомиелин
0,17
0,18
0,20
Лизолецитин
0,08
0,11
0,15
Старт
0,0
0,0
0,0
Значительную помощь в идентификации отдельных фосфолипидов оказывают специальные реакции. Так, фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин обнаруживаются после опрыскивания раствором нингидрида: 3 г нингидрида растворяют в 5 мл лутидина (2,6-диметилпиридин) и добавляют 95 мл н-бутанола, насыщенного водой. Появляется малиновая окраска, характерная для аминогрупп.
154
Фосфолипиды, содержащие холин (фосфатидилхолин, лизо-фосфатидилхолин и сфингомиелин), окрашиваются в оранжевый цвет реактивом Драгендорфа, который готовят из двух растворов: раствор I содержит 1,7 г Bi(N03)3 • 5H2O в 100 мл 20%-ного раствора уксусной кислоты; раствор II содержит 40 г KI в 100 мл воды. Пластинки опрыскивают смесью, состоящей из 4 мл раствора I и 1 мл раствора II с добавлением 20 мл воды.
Фосфатидилинозитол окрашивается в коричневый цвет аммиачным раствором серебра, который состоит из равных объемов 0,1 н. раствора AgNO3 и 1 н. раствора NH3.
Количество индивидуальных фосфолипидов после TCX определяют по содержанию в них фосфора по методике, описанной выше для фосфолипидов.
Поскольку фосфолипиды разных подклассов содержат неодинаковое количество фосфора, их соотношение в исследуемых материалах выражают в мкг (мг) или в процентах неорганического фосфора по отношению к его содержанию в общих фосфолипидах.
3.3.6.4. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КЛАССОВ ЛИПИДОВ ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫМ МЕТОДОМ
Принцип. В основе метода лежит фотометрия плотности окраски отдельных классов липидов, разделенных методом ТСХ, в отраженном или проходящем свете.
Реактивы: пластинки «Силуфол», UV-254 (Чехия) для качественного анализа методом TCX размером 150 х 150 мм;
стеклянные пластинки размером 200 х 200 мм;
подвижная фаза: петролейный эфир диэтиловый, эфируксусная кислота (85 : 15 : 1);
стандартная смесь липидов в хлороформ-метаноловой смеси (2 : 1) (табл. 26);
26. Примерный состав стандартной смеси липидов, %
Класс липидов
Источник липидов
Смесь, предназначенная для
животных
птиц
Фосфолипи-
Лецитин синтетический или вы-
30-40
50-60
ды
деленный методом TCX из яич-
ного желтка
Холестерин
Холестерин синтетический
3-6
1,5-3
(ч. д. а.)
НЭЖК
Пальмитиновая, стеариновая
3-5
0,3-1
или олеиновая кислота, или их
смесь (ч. д. а.)
Триацилгли-
Триолеин (ч. д. а.)
10-15
30-40
церины
Холесте-
Холестерин-пальмитат или хо-
30-35
1,5-3
рин-эфир
лестерин-олеат (ч. д. а.)
155
3—5%-ный раствор фосфорномолибденовой кислоты в этаноле (свежеприготовленный).
Оборудование: денситометр — интегратор или сканиметр (отечественного или зарубежного производства); микрошприц на 1—5 (10) мкл; пульверизатор плюс все оборудование, используемое для разделения липидов методом ТСХ.
Ход определения. На пластинку «Силуфол» (после ее активизации в термостате при 100—105 °С в течение 3—5 мин) наносят микрошприцем не более 6 проб липидов (по 0,06—0,1 мг) в виде тонкой полосы шириной 8—10 мм (если используют стеклянные пластинки с более толстым слоем, то можно нанести 8—9 проб липидов по 0,2—0,3 мг и более). Пластинку опускают в камеру и после разгонки извлекают, подсушивают в горизонтальном положении, осторожно опрыскивают спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты и прогревают в сушильном шкафу при 90—100 °С до появления четко выраженных пятен сине-голубого цвета (1—2 мин).
Запись фракций липидов проводят в день их разделения (при хранении обесцвечиваются). Для этого пластинку «Силуфол» разрезают ножницами по числу нанесенных проб (но не шире 4 см), вкладывают в кассету денситометра и записывают при красном светофильтре в отраженном свете. Каждый класс липидов на хро-матограмме выписывается в виде пика. Порядок расположения пиков тот же, что и на стеклянных пластинках. При разделении липидов сыворотки крови коров триацилглицерины нередко дают 2—3 следующих друг за другом пятна (пика).
Расчет. Относительную величину липидов отдельных классов рассчитывают по величине пиков. Для этого сначала определяют абсолютную площадь пиков путем умножения его высоты* на ширину на половине высоты от базисной линии. Полученные величины разных пиков суммируют и принимают за 100 %, а затем находят процентную долю каждого пика.
Полученные данные, как правило, не отражают действительную величину липидов соответствующего класса. Поэтому для каждого класса следует найти свой поправочный коэффициент. Для этого готовят стандартный раствор — смесь липидов определяемых классов (см. табл. 26) в хлороформ-метаноловой смеси. Небольшое количество смеси упаривают до концентрации 1—3 %, с помощью микрошприца наносят на пластинку в 8—10 повторностях и разгоняют при тех же условиях, как описано выше. После окраски пики записывают на денситометре и высчитывают относительную площадь каждого пика. Затем процентное содержание отдельного класса стандартной смеси делят на процентное содержание соответствующего класса, найденного после
